Молекулярно – ситовая хромотография

 

Лиофильные золи получают путем растворения высокомолекулярных веществ в соответствующих растворителях: белков в воде, каучука в бензоле, целлюлозы в эфире и т.д. Из этих веществ наибольшее биологическое значение имеют воднорастворимые (гидрофильные) золи белков, крахмала и др.

Лиофильные золи, являющиеся растворами высокомолекулярных соединений, обладают значительно большей устойчивостью по сравнению с лиофобными золями, поэтому они могут быть получены в сравнительно высоких концентрациями, следовательно, обладают большей вязкостью и осмотическим давлением. Повышение концентрации лиофильных растворов приводит к застудеванию – переходу в гели. Последние обладают свойством обратимости.

Принцип хромотографии, разработанный в 1903 г. русским ученым М. С. Цветом, основан на способности пигментов (или любых других окрашенных и неокрашенных веществ) специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонке.

В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элюенты, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают в коллекторе фракций (принцип сорбции-десорбции).

Чрезвычайно эффективным средством фракционирования белков ( разделения) из смеси оказалась колоночная хромотография с гидроксилапатитом, различными ионообменными смолами и производными целллюлозы в качестве носителей. При выделении и очистке белкков используют четыре основных типа хромотографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную (хромотография по сродству) – в соответствии с разными физическими и химическими механизмами, лежащими в основе каждого из них. Хромотография широко применяется не только для выделения белков, но и для разделения множества других органических и неорганических веществ, входящих в состав живых организмов.

Адсорбционная хромотография.

Разделение компонентов смеси (образца) основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте. В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще всего буферным раствором) вносят в стеклянную вертикальную трубку (колонку) и равномерно в ней упаковывают. Образец в небольшом объеме растворителя наносят на колонку –

Рис. 1.3. Абсорбционная хроматография (схема).

Разделение двух разных веществ (А и В), перемещающихся по колонке с разной скоростью.

1 - нанесение образца на колонку; 2 -середина опыта; 3 - окончание опыта.

Компоненты разделяемой смеси адсорбируются на адсорбенте. Затем приступают к стадии освобождения – десорбции компонентов из колонки, применяя подходящие элюенты (рис. 1.3). Сбор фракций осуществляют при помощи автоматического коллектора фракций.

 

Распределительная хромотография.

В отличие от адсорбционной твердая фаза служит только опорой (основой) для стационарной жидкой фазы. Один из типов распределительной хромотографии, как и адсорбционная, осуществляется на колонках, в которых в качестве стационарной фазы применяют влажный крахмал или силикагель. Образец растворяют в подходящем растворителе, затем наносят на колонку; разделяемые вещества, подвергающиеся многократному распределению между неподвижной стационарной фазой (водный слой) и движущейся фазой органического растворителя, с разной скоростью перемещаются ко дну колонки. Собранные при помощи коллектора фракции пробы, содержащие одно вещество, соединяют для выделения этого вещества в чистом виде.

Разновидностью распределительной хромотографии является хромотография на бумаге, широко используемая, в биохимических лабораториях, в том числе клинических, для разделения пептидов, аминокислот и других веществ (рис. 1.4). В качестве стационарной фазы при этом служит вода, адсорбированная целлюлозными цепями фильтровальной бумаги. Образец помещают на одном конце бумажной полосы, этим же концом бумагу погружают в подходящую смесь органических растворителей (например, бутанол–уксусная кислота–вода в определенных соотношениях). При движении растворителя по бумаге благодаря силе капиллярности происходит разделение компонентов смеси. Проявленную хроматограмму высушивают, а местоположение каждого из разделяемых веществ определяют химическими или физико-химическими методами.

Рис. 1.4. Хромотография на бумаге (схема).

А – восходящая хромотография; Б – нисходящая хромотография (вид сбоку); В – хроматограмма с разделенными и окрашенными веществами:

 1 – фронт растворителя, 2 – разделенные вещества, 3 – место нанесения образца.

 

⇐ Предыдущая1234567Следующая ⇒

Поделиться: