Аффинная хромотография( хромотография по сродству).

Основана аффинная хромотография на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными) на носителе специфическими веществами – лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент), антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с носителем (которым заполняют хроматографическую колонку), присоединяется только один какой-либо белок из смеси. Снятие с колонки этого белка осуществляют элюированием буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой, а также введением в состав элюента детергентов, ослабляющих связи между белками и лигандами. Несомненным достоинством метода является возможность одноэтапно выделить заданный белок или другой биополимер высокой степени чистоты. При помощи аффинной хромотографии, например, удалось сравнительно легко выделить очищенные препараты аминоацил –тРНК -синтетаз на полиакрилгидразидагаровом геле, к которому в качестве лигандов были присоединены определенные тРНК (транспортные РНК).

 

Гель-хроматография.

 

В препаративных целях, особенно при очистке белков от примесей, широко используют метод молекулярных сит, или гель-хроматографию. При обработке эпилхлоргидрином полисахарида дек-страна образуются различной степени выраженности поперечные связи, приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен, нерастворимых в воде и называемых сефадексами. Благодаря большому сродству к воде зерна сильно набухают в водной среде с образованием геля, которым заполняют хроматографическую колонку. Разделение веществ этим методом основано на том, что большие молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу геля, являющуюся стационарной, и остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки; небольшие молекулы, напротив, свободно диффундируют внутрь зерен, образуя равновесную систему между подвижной и стационарной фазами, и соответственно с меньшей скоростью двигаются вдоль колонки (рис. 1.5). Обычно момент появления веществ в вытекающем из колонки с сефадексом элюенте выражают формулой:

где V – объем элюирующей жидкости вещества с данным К, мл;

 V₀ – свободный объем колонки или общий объем внешнего растворителя (вне зерен геля), мл;

V_i – объем растворителя внутри геля, мл;

K – коэффициент распределения для растворенного вещества между растворителем внутри зерен геля и окружающим растворителем.

 Если анализируемую пробу, содержащую одно растворенное вещество с К = 1 и второе с К = 0, внести в колонку с сефадексом, то второе вещество появится в элюирующей жидкости сразу после выхода из колонки V₀ , а первое – только после выхода объема V₀+ V_i.

Поскольку молекулы белков, обладающие большими молекулярными массами и размерами, не диффундируют внутрь зерен сефадекса, они первыми вымываются из колонки после выхода свободного объема колонки V₀, в то время как все остальные вещества (включая низкомолекулярные примеси) вымываются после выхода объема, равного V₀+ К • V_i.

Метод нашел широкое применение в препаративной энзимологии. С помощью сефадекса можно разделить белки с разной молекулярной массой.

 

16. Расположите ионы Fe³⁺ Co²⁺ Cu²⁺ в порядке уменьшения их адсорбционной активности на полярном адсорбенте Al₂ O₃

 

16.1 Fe³⁺ > Co²⁺ >Cu²⁺

 

Адсорбция зависти не только от природы поглотителя, но и от природы поглощаемого вещества. Когда в растворе содержится не одно, а несколько веществ, то они будут адсорбироваться адсорбентом в соответствии с их адсорбционной способностью. Однако, если сначала адсорбируется одно адсорбционно-активное вещество, а затем в раствор добавляют другое, более адсорбционно-активное, то происходит вытеснение первого вещества вторым. При этом соотношение количества адсорбированных поглотителем веществ будет соответствовать их адсорбционной активности. Например, катионы тяжелых металлов адсорбируются лучше, чем катионы такой же валентности легких металлов.

Адсорбенты делят на две основные группы: полярные и аполярные. Полярные адсорбенты состоят из поляризованных молекул с достаточно большой долей ионной связи (например, алюмоселикаты), аполярные – из неполярных молекул, атомов (например, уголь). Адсорбционное сродство полярных веществ к полярным адсорбентам значительно выше, чем аполярных веществ к полярным адсорбентам значительно выше, чем аполярных веществ к полярным адсорбентам Примером избирательной адсорбции является ионная адсорбция – адсорбция сильных элктролитов из водных растворов. Ионы из раствора электролита адсорбируются на поверхности адсорбента, состоящего из полярных молекул или ионов. Почти всегда на такой поверхности один из ионов адсорбируется избирательно. Поэтому ионную адсорбцию часто называют полярной адсорбцией. Катионы и анионы обладают различной адсорбционной способностью в силу различия их природы.

Согласно первому правилу (сформулированному К.Фаянсом, Ф. Панетом и Н.П. Песковым) на твердой поверхности адсорбента преимущественно адсорбируются ионы, входящие в состав адсорбента, или имеющие общую с данной поверхностью атомную группировку (или изоморфную с ней).

Поверхность адсорбентов, образованная полярными молекулами, в растворах электролитов обладает электрическим зарядом вследствие диссоциации иогенных групп адсорбента или вследствие избирательной адсорбции. Микроучастки поверхности адсорбента, несущие определенный заряд, абсорбируют противоположно заряженные ионы электролита – это второе правило Фаянса -Панета -Пескова. При этом ионы электролита противоположного знака непосредственно не адсорбируются, но действием сил электростатического притяжения остаются вблизи адсорбированных ионов, образуя с ними на поверхности адсорбента так называемый двойной электрический слой.

Радиус ионов сильно влияет на их способность адсорбироваться. Ионы одинаковой валентности адсорбируются тем лучше, чем больше их эффективный радиус (радиус в кристаллической решетке), причина этого заключается в том, что поляризующее действие иона тем больше, чем меньше его размер. А это в свою очередь приводит к различной степени гидратации ионов. Ионы большого радиуса (при одном и том же заряде) гидратируются в меньшей степени, а потому их гидратная оболочка в меньшей степени препятствует адсорбции. Гидратная оболочка препятствует адсорбции ионов, так как она уменьшает электрическое взаимодействие.

Ионы расположенные в порядке возрастания (или уменьшения) адсорбционной способности образуют ряды, которые называют лиотропными рядами (или рядами Гофмейстера).

Многовалентные ионы адсорбируются значительно лучше одновалентных ионов, практически независимо от природы адсорбента.

В нашем случае согласно 1и 2 правилу наиболее активным будет ион железа, ионы кобальта и никеля имеют одинаковый заряд, но медь может менять валентность I и II, поэтому в ряду активности следующий ион кобальта, и последний –ион меди.

.

 

 

 

17. Какой из методов наиболее эффективен для очистки морской воды от MgCl₂?

 

17.4 ионообменная хромотография с последовательным использованием катионита и анионита.

 

Адсорбция называется эквивалентной, если адсорбируется одинаковое число положительно заряженных и отрицательно заряженных ионов.

Адсорбция может быть и обменной. Она наблюдается в тех случаях, когда ион одного знака адсорбируется лучше, чем ион с противоположным знаком. При этом сохранение электронейтральности раствора достигается тем, что из адсорбента вытесняется в раствор электролита эквивалентное число ионов с зарядами того же знака, как у адсорбируемых ионов.

Типичным примером адсорбентов проявляющих обменную адсорбцию могут служить природные цеолиты (водные алюмоселикаты натрия и кальция) или искусственные перумиты того же состава. Они хорошо поглощают ионы кальция и магния, выделяя в раствор эквивалентное количество ионов натрия. Это свойство цеолитов и пермутитов широко используется для уменьшения жесткости воды.

Через четвертую колонку с отработанным по магнию катионитом КБ-4 пропускают раствор следующего состава: Na2CO3 3,14 г/л, NaHCO3 0,59 г/л при температуре 20oC. Общая концентрация 3,73 г/л по натрию, мольное соотношение карбоната и бикарбоната 1:0,376, pH раствора 9,6. Далее, наименование смеси данного состава "АЛ".

Скорость пропускания раствора 60 мл/час, время пропускания 2 ч. Концентрация по Mg2+ в максимуме 0,51 г-экв/л, содержание Mg2+ в максимуме 0,51 г-экв/л, содержание Mg2+ во всем фильтрате 0,38 г-экв/л.

 

18. Разделение смеси веществ в аффинной хромотографии происходит благодаря:

⇐ Предыдущая1234567Следующая ⇒

Поделиться: