После разделения необходимо идентифицировать все компоненты и оценить их количественно. Такова общая схема хроматографии.

Следует отметить, что этот современный метод позволяет в течение нескольких минут определить содержание десятков и сотен различных соединений в смеси, причем даже в ничтожных, «следовых» количествах ~10–8%.

Рассмотрим подробнее хроматографический способ анализа. Хроматографические системы можно разделить по следующим принципам:

– агрегатное состояние подвижной и неподвижной фаз;

– – геометрические характеристики системы;

– – механизм взаимодействия между разделяемым веществом и фазами.

В качестве подвижной фазы используется газ или жидкость. В качестве неподвижной, или стационарной, фазы применяются твердые вещества или жидкости.

По расположению фаз хроматографические системы подразделяют на две группы: плоскостные и колоночные.

Последние, в свою очередь, разделяются на:

– насадочные, заполненные зернистым твердым материалом (мелкие шарики), либо являющимся разделительной средой, либо служащим носителем неподвижной жидкой фазы;

– капиллярные, внутренние стенки которых покрыты пленкой неподвижной жидкости или слоем твердого адсорбента (поглотитель).

Взаимодействие между разделяемым веществом и фазами хроматографической системы может осуществляться или на поверхности фазы, или в объеме. В первом случае хроматография называется адсорбционной, во втором – распределительной.

Механизмы разделения молекул в хроматографических системах чаще всего сводятся к следующим:

– неподвижная фаза физически поглощает (сорбирует) разделяемые вещества;

– – неподвижная фаза химически взаимодействует с разделяемыми веществами;

– – неподвижная фаза растворяет разделяемые вещества из раствора в несмешивающемся растворителе;

– – неподвижная фаза имеет пористую структуру, затрудняющую диффузию молекул разделяемых веществ в этой фазе.

Хроматография, начавшись с самодельных устройств типа полоски бумаги, опущенной в растворитель, в настоящее время представлена сложнейшими инструментальными системами, основанными на современных точнейших, или прецизионных, принципах и оснащенными компьютерным обеспечением. Достаточно сказать, что одна из лучших компьютерных фирм «Хъюлетт-Паккард» одновременно выпускает и современные хроматографы.

Схема процесса хроматографирования, в сущности, очень проста и показана на рис. 3. Далее примерно в такой последовательности будет рассмотрен принцип работы хроматографа.

Основные виды хроматографии

К основным видам хроматографии относят адсорбционную, ионообменную, жидкостную, бумажную, тонкослойную, гель-фильтрационную и афинную хроматографию.

Жидкостную хроматографию подразделяют на несколько классов в зависимости от типа носителя неподвижной фазы.

Пропускание элюента через колонку под высоким давлением позволило резко увеличить скорость анализа и существенно повысить эффективность разделения за счет использования мелкодисперсного сорбента. Метод ВЭЖХ в настоящее время позволяет выделять, количественно и качественно анализировать сложные смеси органических соединений.

По механизму взаимодействия разделяемого вещества (элюата) с неподвижной фазой различают адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, ион-парную, лигандообменную и аффинную хроматографии.

Аффинная хроматография основана на специфических взаимодействиях разделяемых белков (антител) с привитыми на поверхности сорбента (синтетической смолы) веществами (антигенов), избирательно образующими с белками комплексы (коньюгаты).

Афинная хроматография. Этот вид хроматографии основан на взаимодействии между веществом, с одной стороны, способным реагировать с выделяемым соединением, а с другой – связанным с твердым носителем неподвижной фазы. Такое вещество обладает сродством к выделяемому соединению и называется афинным лигандом.

Наиболее часто этот метод находит применение в биохимическом анализе. Например, при пропускании через целлюлозу, активированную бромцианом, биологических объектов-антигенов, содержащих белки, происходит их специфическое удерживание, как показано на схеме 1.

По другому способу для присоединения белков к гидроксильной группе целлюлозы последнюю сначала обрабатывают 2-амино-4,6-дихлор-сим-триазином, а затем продукт их взаимодействия вступает в реакцию с аминогруппой белка по схеме 2:

19. В молекулярно-ситовой хромотографии первым из разделительной колонки выходят:

⇐ Предыдущая1234567

Поделиться: