ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И МИКОЛОГИЯ. Содержание лабораторных занятий

Стр 1 из 7Следующая ⇒

ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И МИКОЛОГИЯ

Часть I Общая микробиология

Методические указания к лабораторным занятиям

для обучающихся по специальности 36.05.01. Ветеринария

уровень высшего образования специалитет

квалификация: специалист

форма обучения: очная

Троицк 2017

УДК 619:579(07)

ББК 48.41я73

Утверждено на заседании Методической комиссии факультета ветеринарной медицины протокол № 8а от 23.03.2017 г.

Рецензент: М. В. Киселёва М.В. кандидат сельскохозяйственных наук, доцент кафедры управления качеством сельскохозяйственного сырья и потребительских товаров

Епанчинцева, О. В. Ветеринарная микробиология и микология методические указания к лабораторным занятиям для обучающихся по специальности 36.05.01. Ветеринария, уровень высшего образования – специалитет, форма обучения – очная /О. В. Епанчинцева. – Троицк : ФГБОУ ВО Южно-Уральский ГАУ, 2017. – 35 с.

В методических указаниях представлены тематика, содержание лабораторных занятий по разделу «Общая микробиология» дисциплины «Ветеринарная микробиология и микология», включая цель, план занятия, теоретический материал, практические задания, вопросы и задания для контроля знаний, рекомендуемую литературу. Методические указания предназначены для обучающихся по специальности 36.05.01. Ветеринария уровень высшего образования специалитет.

УДК 619:579(07)

ББК 48.41я73

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение……………………………………………………………………………………	4
1 Тематика лабораторных занятий……………………………………... .……………….	5
2 Содержание лабораторных занятий …………………………...……………………….	6
Тема 1 «Бактериологическая лаборатория, правила работы и техника безопасности в ней. Иммерсионная система микроскопа. Основные формы бактерий»………………	6
Тема 2 «Приготовление и окрашивание бактериальных препаратов. Краски и красящие растворы. Методы окраски бактерий (простой и сложный – метод Грама)»	7
Тема 3 «Специальные методы окраски бактерий. Определение подвижности бактерий»…………………………………………………………………………………….	12
Тема 4 «Методы изучения морфологии грибов и дрожжей»..…………………………..	15
Тема 5 «Стерилизация. Питательные среды»..……………………………………………	18
Тема 6 «Методы культивирования и выделения чистых культур микроорганизмов»..	23
Тема 7 «Методы изучения культуральных и биохимических свойств бактерий»………	27
Тема 8 «Изучение антибиотикочуствительности бактерий. Бактериофаги»..………….	31
Рекомендуемая литература и источники………………………………………………….	35

Введение

Методические указания составлены в соответствии с рабочей программой, тематическим планом дисциплины «Ветеринарная микробиология и микология», с требованиями ФГОС ВО по специальности 36.05.01 Ветеринария, уровень высшего образования специалитет, утвержденного МОиН РФ 03.09. 2015 г. № 962 и предназначены для самостоятельной работы обучающихся факультета ветеринарной медицины на лабораторных занятиях по указанной дисциплине.

Специалист по специальности 36.05.01 Ветеринария должен быть подготовлен к врачебной, экспертно-контрольной и научно-исследовательской деятельности.

Целью дисциплины является освоение обучающимися в соответствии с формируемыми компетенциями теоретических и практических знаний о многообразии биологических объектов, изучаемых по общей и частной ветеринарной микробиологии и микологии, приобретении умений и навыков в области приемов и методов диагностики инфекционных болезней животных, конструирования рекомбинантных бактерий вакцинных штаммов и продуцентов биологически активных веществ, создания новых видов диагностикумов, вакцин и сывороток.

Задачи дисциплины.

Изучение:

- объектов ветеринарной микробиологии, их морфологии, физиологии, экологии, эволюции.

- возбудителей инфекционных болезней животных.

- методов современной микробиологии, ее возможностей, достижений и перспектив развития.

- основ санитарной микробиологии.

- основ инфекционного процесса и факторов патогенности микроорганизмов.

- основ иммунологии и факторов иммунного ответа организма животных на возбудителей инфекционных болезней.

- перспективных и экологически безопасных технологических процессов, основанных на использовании микроорганизмов.

Овладение практическими навыками:

- проведения классических и генотипических методов лабораторной диагностики инфекционных болезней животных.

- изучения строения бактерий и микроскопических грибов, генетики микроорганизмов, тинкториальных, культуральных, биохимических, патогенных свойств, антигенной структуры.

- изготовления диагностикумов и перспективных путей совершенствования технологии их производства с использованием достижений молекулярной биологии, иммунологии, генной и клеточной инженерии.

Методические указания включают тематику, цель, план, материальное обеспечение, теоретический материал лабораторных занятий раздела «Общая микробиология», практические задания, вопросы для контроля знаний, список литературы и источников. При выполнении практических заданий на лабораторных занятиях обучающиеся, руководствуясь методическими указаниями, изучают теоретический материал, проводят необходимые исследования, заполняют соответствующие таблицы в рабочей тетради, делают зарисовки, схемы. Проводят учет и оценку полученных результатов с последующим обсуждением и подведением итогов занятия, отчитываются преподавателю.

Содержание лабораторных занятий

План

1. Бактериологическая лаборатория

2. Правила работы с иммерсионной системы микроскопа

3. Изучение морфологии бактерий

Материальное обеспечение: микроскопы, набор реактивов для микроскопирования, готовые окрашенные препараты (кокки, палочки, дрожжи), демонстрационные плакаты по теме занятия (Основные формы бактерий, Правила работы в лаборатории, Ход лучей в иммерсионной системе микроскопа).

Теоретический материал

Бактериологическая лаборатория – это государственное учреждение, имеющее специальное оборудование и штат подготовленных специалистов для производства микробиологических исследований.

Основная задача бактериологической лаборатории – диагностика болезней сельскохозяйственных животных, пушных зверей, рыб, пчел, а также проведение экспертизы молока, мяса и других пищевых продуктов и кормов.

Лабораторию размещают в отдельном здании, вдали от проезжих дорог.

Отделы и подразделения лаборатории: приемное отделение, бактериологический,

вирусологический, биохимический, серологический, бактериологическая кухня,

виварий.

Правила работы и техника безопасности в бактериологической лаборатории:

1. Входить в лабораторию и работать в ней только в спецодежде (халат, косынка или колпак, сменная обувь).

2. В помещении лаборатории не принимать пищу и воду, не курить, не допускать излишних разговоров и ненужных переходов.

3. Работать сидя на своем рабочем месте, соблюдать чистоту и аккуратность в работе, по окончанию работы руки тщательно вымыть, при необходимости продезинфицировать.

4. Использованные пипетки, предметные и покровные стекла, шпатели, ватные тампоны помещать в сосуд с дезинфицирующим средством. Пинцеты, бактериальные петли, иглы прожигать в пламени горелки.

5. Отработанные культуры, использованный микробный материал, трупы зараженных животных сдавать лаборанту для обеззараживания в автоклаве.

6. Предметы, случайно загрязненные зараженным материалом, подвергать немедленной дезинфекции.

Микроскоп – сложный оптический прибор, предназначенный для рассматривания мелких объектов, увеличивающий изображение изучаемых объектов в 500-3000 раз. Обычный биологический микроскоп состоит из 2-х систем: механической и оптической.

Механическая система состоит из: штатива с подставкой, к которому прикреплен предметный столик, тубус, «револьверная» насадка и винты для перемещения тубуса.

Оптическая система состоит из: окуляра, объектива, конденсора и зеркала.

Правила работы с микроскопом.

1. Переносить микроскоп, держа перед собой, только двумя руками.

2. Микроскоп удобно поставить на стол и равномерно осветить поле зрения. Для этого: поднять конденсор, открыть диафрагму, установить малый объектив, наблюдая в окуляр, поворотом зеркала добиться равномерного и яркого освещения поля зрения.

3. На предметный столик кладут препарат и исследуют в сухой или иммерсионной системе.

4. Сухая система – работа с малым (8-10) или средним (20-40) объективами – используют макро- и микровинты медленно и осторожно, не касаясь предметного стекла, добиваются четкого изображения объекта.

5. Иммерсионная система – работа с большим (иммерсионным) объективом (90). На препарат наносят каплю иммерсионного масла; глядя сбоку, объектив опускают в масло, не допуская соприкосновения с предметным стеклом. Смотря в окуляр, медленно поднимают тубус микроскопа до появления изображения объекта, затем микровинтом наводят наилучшую резкость и ясность изображения.

6. При работе с микроскопом не применять большого усилия во избежании порчи микроскопа.

7. По окончании работы необходимо: объектив протереть от масла салфеткой, протереть столик и опустить конденсор; револьвер перевести на малый объектив (8-10), опустить, подложив на столик под объектив, салфетку; сдать микроскоп в лаборантскую №306 (поставить в шкаф).

Основные формы бактерий:

1. Шаровидные (кокки) – монококки, диплококки, тетракокки, стрептококки, стафилококки, сарцины;

2. Палочковидные – истинные бактерии, бациллы, клостридии;

3. Извитые – вибрионы, спириллы, спирохеты.

Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания.

Практическое задание 1: Исследовать окрашенные мазки-препараты бактерий.

Этапы выполнения задания:

1 Настроить освещение поля зрения микроскопа, выбрать необходимую систему для исследования мазков-препаратов.

2 Внимательно изучить и зарисовать в тетрадь обнаруженные в поле зрения микроскопа бактериальные клетки.

3 Определить форму бактериальных клеток и отчитаться преподавателю.

Практическое задание 2: Исследовать окрашенные мазки-препараты дрожжей.

Этапы выполнения задания:

2 Внимательно изучить, зарисовать в тетрадь обнаруженные в поле зрения микроскопа дрожжевые клетки и отчитаться преподавателю.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Дайте определение бактериологической лаборатории. 2 Обоснуйте правила работы в бактериологической лаборатории. 3 С чем связана опасность работы в микробиологической лаборатории? 4 Из каких частей состоит микроскоп? 5 Какие правила необходимо выполнять при работе с сухой и иммерсионной системами микроскопа? 6 Назовите основные формы бактерий. 7 Чем отличается строение эукариотной и прокариотной клеток?

Тема 2 «Приготовление и окрашивание бактериальных препаратов. Краски и красящие растворы. Методы окраски бактерий (простой и сложный – метод Грама)»

Цель – формирование знаний об анилиновых красителях и красящих растворах, умений приготовления мазка-препарата, окраски бактерий, оценить правильность выполнения микроскопических исследований, делать заключение по изученному материалу, навыков работы с источниками информации.

План

1. Краски и красящие растворы

2. Приготовление бактериальных препаратов

3. Методы окраски бактериальных препаратов – простой и метод Грама.

Материальное обеспечение: сухие анилиновые краски, микроскопы, набор красок, реактивов для микроскопирования, микробные культуры бактерий разных форм, демонстрационные плакаты по теме занятия (Анилиновые красители, основные формы бактерий).

Теоретический материал

Основное требование при работе с микроорганизмами – соблюдение асептики, т. е. таких условий, при которых в пробирку с изучаемой культурой не смогли бы попасть другие микроорганизмы (например, из воздуха, с предметов, используемых в процессе выполнения работы). Кроме того, нужно иметь в виду, что среди микроорганизмов многие условно патогенны, что требует повышенного внимания и аккуратности в работе. Для работы с микроорганизмами используют специальные бактериологические петли, иглы, шпатели. Бактериологические петли изготовляют из проволоки, которую закрепляют в специальных металлических держателях или впаивают в стеклянные палочки. Толщина игл и петель не должна превышать 0,5 мм. Выращивают микроорганизмы в стеклянной посуде: пробирках, колбах или чашках Петри. В пробирках микроорганизмы культивируют как в жидкой, так и плотной средах. Пробирки со средами и культурами при работе следует устанавливать на штативах. Бактериологическая петля прокаливается, пробки и край пробирки фламбируются. Если в работе используются суспензии микроорганизмов или культуры, выращенные на жидких средах, они берутся предварительно простерилизованной пипеткой, у которой широкий конец закрыт ватой. Такие пипетки стерилизуют и хранят завернутыми в бумагу (каждая отдельно).

Изучают микроорганизмы, изготавливая препараты из них. Для этого применяют чистые, хорошо обезжиренные стекла, на поверхности которых капля воды свободно растекается. С этой целью промытые и высушенные стекла хранят в растворе спирт-эфира (1:1). При микроскопировании можно использовать культуры, выращенные в жидких средах. Культуры, выращенные на плотных средах, можно суспендировать (развести) с помощью стерильной петли или иглы в капле стерильной жидкой среды или какого-нибудь раствора, но не водопроводной воды, до слабого помутнения.

В зависимости от цели исследования готовят прижизненные или фиксированные препараты.

Фиксированный (постоянный) препарат готовят следующим образом:

1) приготовить суспензию микроорганизмов методом, аналогичным вышеописанному;

2) с помощью стерильной бактериологической петли распределить суспензию тонким слоем на поверхности предметного стекла в виде пятна диаметром около 1 см;

3) высушить мазок на воздухе;

4) фиксировать мазок в пламени спиртовки. Для этого препарат три раза проводят в средней части пламени спиртовки. При этом микроорганизмы погибают, хорошо прикрепляются к стеклу, становятся более восприимчивыми к красителю. Можно вместо термической проводить химическую фиксацию, предусматривающую применение средств, вызывающих коагуляцию белков. В этом случае она осуществляется с помощью определенных химических веществ (например, метиловый, этиловый спирты, формалин) или различных смесей (например, уксусная кислота, абсолютный этиловый спирт и хлороформ – фиксирующая смесь Карнуа).

Для микроскопического исследования приготовленные мазки, высушенные и зафиксированные, подвергают окраске. Наиболее пригодными для окраски микробов являются анилиновые краски. Анилиновые краски поступают в продажу в виде сухих порошков, из которых в лабораториях приготовляют растворы. Сначала готовят насыщенные спиртовые растворы, сохраняющиеся впрок, но сами по себе непригодные для окраски бактерий. Из них приготовляют разведенные спиртоводные растворы, которые и применяют в повседневной практике.

Красители, у которых при диссоциации выделяются водородные ионы, придающие красителю кислый характер, называются кислыми. Они окрашивают (в виде аниона) вещества основной природы. Красители, у которых при диссоциации выделяются гидроксильные ионы называются основными.

В микробиологической практике кислые и основные красители используются в виде солей, так как они способны вступать в реакцию с кислотами и основаниями. Основные красители чаще применяются в виде солей соляной, реже уксусной и серной кислот; кислые красители - в виде натриевых или калийных солей.

Интенсивность окрашивающей способности красителя зависит от рН среды: основные красители окрашивают объект тем интенсивнее, чем более щелочная среда, кислые - чем более кислая.

Красители можно разделить на: позитивные и негативные. Позитивные красители окрашивают непосредственно клетки микроорганизмов. Они окрашивают клетки при комнатной температуре в течение 30-60 секунд. Негативные красители окрашивают пространство, окружающие клетки микроорганизмов. В результате клетки выглядят силуэтами на фоне красителя.

Таблица 2 – Красители основной природы

Красные: нейтральный красный, пиронин, сафранин, фуксин, тионин	Фиолетовые: геницианвиолет, кристаллический фиолетовый, метиловый фиолетовый
Синие: гематоксилин, виктория, метиленовый синий	Черный: индулин
Зеленые: метиловый зелёный, малахитовый зелёный	Коричневые: везувин, хризоидин

Таблица 3 – Красители кислой природы

Красные и розовые: кислый фуксин, эритрозин, флюоресцин

Черные: нигрозин

Желтые: конго, пикриновая кислота

Приготовление красок для простого окрашивания.

Фуксин (солянокислый, уксуснокислый или сернокислый розанилин, дериват трифенилметана) употребляется в микробиологической практике чаще всего. Он готовится в виде концентрированного карболового раствора — фуксина Циля, очень стойкого и пригодного для окраски в течение многих месяцев. В таком виде он употребляется только для объектов, с трудом воспринимающих окраску (кислотоупорные бактерии, споры).

Для окраски большинства бактерий фуксин Циля разводят в 10 раз дистиллированной водой, получая так называемый разведенный, или водный фуксин. Разведенный фуксин очень нестоек и поэтому приготовляется непосредственно перед окрашиванием препарата.

Карболовый фуксин (фуксин (основной) - 1 г, карболовая кислота кристаллическая - 5г, спирт 96° - 10 мл, глицерин - несколько капель, вода дистиллированная - 100 мл). Порошок фуксина тщательно растирают с карболовой кислотой в ступке, добавив несколько капель глицерина. Во время растирания приливают понемногу спирт. Когда смесь превратится в полужидкую кашицу (без комков!), приливают понемногу, продолжая все время размешивать, дистиллированную воду. Дают постоять двое суток, после чего фильтруют.

Водный фуксин (карболовый фуксин - 1 мл, дистиллированная вода -9 мл).

Метиленовый синий готовится заранее в насыщенном растворе. (метиленовая синяя - 10 г, спирт 96° - 100 мл). Из этого раствора готовят щелочную синюю краску. Насыщенный спиртовой раствор метиленовой синей (профильтрованный) - 30 мл, едкий натр (или едкий калий) 1% - 1мл, дистиллированная вода ~ 100 мл. Раствор стоек и может долго храниться.

Окраска бывает простая и сложная.

Простая окраска заключается в нанесении на мазок какой-либо одной краски на определенное время. Чаще всего для простой окраски применяют водно-спиртовый 1:10 фуксин, метиленовую синьку и сафранин. При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из чистой культуры) окрашиваются в тот же цвет, но несколько бледнее. Обычно фуксином 1:10 красят 10–30 с., а ме- тиленовой синькой – 2–10 мин. Фуксин и генцианвиолет окрашивает мазки более интенсивно. А при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Восприятие окраски зависит не только от свойств красок, но и от свойств подвергаемых окраске микробов. Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой. Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящих бумаг в течение неограниченно долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окраски. Окраска мазков растворами красителей. На высушенный и фиксированный препарат пипеткой наносят краситель в таком количестве, чтобы он покрывал весь мазок. При окраске мазков концентрированными растворами красителей (карболовый фуксин Циля, карболовый генциановый или кристаллический фиолетовый) окрашивание производят через фильтровальную бумагу, задерживающую частицы красителя: на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор красителя. Окраска мазков красящей бумагой. На высушенный и фиксированный препарат наносят несколько капель воды, кладут окрашенные бумажки величиной 2×2 см. В течение всего времени прокрашивания бумага должна оставаться влажной и плотно прилегать к поверхности стекла. При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется методом окраски. По окончании окраски бумагу осто- рожно снимают пинцетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой. Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Сложные методы окраски основаны на особенностях физико- химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в том, что один и тот же препарат обрабатывают несколькими красителями. После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Обмывание мазка простой водой также является чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполное. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых. Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые кислото- и спиртоустойчивы, другие только кислотоустойчивы. Наконец, некоторые, например споры, энергично противостоящие воздействию всех обесцвечивающих веществ, относятся к группе краскоустойчивых.

Сложные методы окраски имеют дифференциально-диагностическое значение для характеристики изучаемого микроба. К сложным методам окраски относятся: окраска по методу Грама, окраска спор и т. д.

Все бактерии в зависимости от способности окрашиваться по Граму разделяются на две нетаксономические группы – грамположительные и грамотрицательные формы. Окраска предложена в 1884 г. датским ученым Х. Грамом и позволяет дифференцировать бактерии, принадлежащие к различным видам, но сходные по форме и размерам. При обработке мазков микроорганизмов генцианвиолетом, а затем йодом препарат, окрашенный в черный цвет, обладает свойством обесцвечиваться под действием спирта. При этом одни бактерии также обесцвечиваются, а другие окрашиваются в фиолетовый цвет. При дополнительной окраске (в частности, разведенным фуксином 1:10) обесцвеченные спиртом бактерии окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). Другие же, прочно удерживающие фиолетовую окраску (соединение йод + генцианвиолет), т. е. не обесцвечивающиеся спиртом, относятся к группе грамположительных бактерий. Различие в окраске объясняется особенностями химического строения бактерий и ультраструктурой клеточных стенок, которые постоянны для определенного вида. Клеточная стенка грамположительных бактерий содержит многослойный муреин со сравнительно часто расположенными сшивками. Белки грамположительных бактерий имеют более кислый характер и лучше окрашиваются основными красителями, чем у грамотрицательных бактерий. Кроме того, грамположительные бактерии содержат рибонуклеат магния, который взаимодействует с образующимся в процессе окраски комплексом и препятствует вымыванию его спиртом. На результат окрашивания оказывают влияние небольшие отклонения в условиях культивирования или в методе окраски, возраст культуры, кислотность среды (в кислой среде, как правило, все бактерии грамотрицательны).

Окраска по Граму производится следующим образом:

1) приготовить на предметном стекле три мазка из бактериальных культур: заведомо известной грамположительной, исследуемой и заведомо известной грамотрицательной;

2) все мазки одновременно высушить;

3) зафиксировать мазки в пламени спиртовки;

4) окрасить 1 %-м раствором генцианового фиолетового в течение 2 минут;

5) краситель слить и, не промывая мазки, залить их раствором Люголя на 1–2 минуты;

6) промыть препарат обильно водой;

7) одновременно на все три мазка нанести 96 % этиловый спирт на 30 секунд;

8) промыть препараты водой (при микроскопировании таких препаратов грамотрицательные бактерии бесцветны);

9) окрасить препараты фуксином течение 2 минут;

10) препараты высушить и микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, гра- мотрицательные – в розовый. При окраске по Граму необходимо точно соблюдать указанные сроки.

Модификацией окраски по Граму является способ Синева, при котором вместо жидкой краски генцианового фиолетового используют полоски фильтровальной бумаги, заранее пропитанные этой краской и высушенные. На фиксированный мазок помещают полоски окрашенной фильтровальной бумаги, на них наносят 2–3 капли воды. Остальные этапы окраски аналогичны классическому методу Грама.

Для определения принадлежности бактерий к таксономической группе используют также экспресс-метод Грезерсона (1979). На предметном стекле в капле 3 %-го раствора КОН готовится суспензия изучаемой культуры. При этом грамположительные бактерии коагулируют, а грамотрицательные образуют вязкую тянущуюся массу.

Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания.

Практическое задание 1: Освоить методику приготовления прижизненных и постоянных препаратов, окрашенных простыми красителями.

Этапы выполнения задания:

1 Приготовить и исследовать с иммерсионным объективом прижизненные препараты культуры бактерий, окрашенные метиленовым синим.

2 Приготовить и исследовать с иммерсионным объективом постоянный (фиксированный) препарат культуры бактерий, окрашенный фуксином.

3 Зарисовать обнаруженные микроорганизмы в тетрадь, определить форму бактерий и отчитаться преподавателю.

Практическое задание 2: Выяснить отношение к окраске по Граму исследуемых культур.

Этапы выполнения задания:

1 Приготовить мазки-препараты из трех музейных микробных культур (№1, 2, 3), окрасить их методом Грама.

2 Выяснить принадлежность данных культур к группе грамположительных или грамотрицательных бактерий.

3 Зарисовать обнаруженные микроорганизмы в тетрадь, определить отношение бактерий по методу Грама и отчитаться преподавателю.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Что такое «асептика»? Почему нужно ее соблюдать при работе с микроорганизмами? 2 Какая посуда используется для выращивания микроорганизмов? 3 Как правильно держать пробирку с микроорганизмами и петлю? 4 Какие свойства микроорганизмов исследуются на прижизненных и постоянных препаратах? 5 Какие анилиновые краски применяют при окрашивании микробных культур?6 Какими методами проводится фиксация микроорганизмов на предметном стекле? 7 Какие красители используют для окраски микроорганизмов? 8. Сколько времени требуется для окрашивания мазка фуксином или метиленовым синим? 9 Как приготовить и зафиксировать мазок из культуры микроорганизмов? 10 Почему необходимо хорошо просушить мазок для иммерсионной микроскопии? 11 Как приготовить растворы красок для окрашивания бактерий простым методом? 12 Для каких целей используют сложные методы окраски? 13 В чем сущность метода окрашивания бактерий по Граму? 14 Почему бактерии окрашиваются по-разному методом Грама? 15 Какова последовательность действий при окрашивании бактерий методом Грама? 16 Какие существуют модификации метода окрашивания по Граму? 17 В чем отличия грамположительных и грамотрицательных бактерий? 18 Какой компонент клеточной стенки является обязательным для грамположительных и грамотрицательных бактерий? 19 В чем сущность экспресс-метода Грезерсона? 20 Что значит «грамвариабельный»? 21 Какие методы окраски микроорганизмов называют сложными? Для чего они используются?

Тема 3 «Специальные методы окраски бактерий. Определение подвижности бактерий»

Цель – формирование знаний о специальных методах окраски мазков-препаратов, умений приготовить, окрасить препараты по методам Пешкова, Златогорова, Михина, Ольта, определения подвижности бактерий, оценить правильность выполнения микроскопических исследований, делать заключение по изученному материалу, навыков работы с источниками информации.

План

1. Изучить методические указания к занятию № 3.

2. Приготовить мазки-препараты из бактериальных культур, окрасить методами Пешкова, Златогорова, Михина, Ольта, изучить в иммерсионной системе микроскопа, зарисовать микробные клетки в тетрадь и отчитаться преподавателю о проделанной работе.

3. Приготовить препараты «висячая» и «раздавленная» капля, определить подвижность микробных культур, отчитаться преподавателю.

Материальное обеспечение: микроскопы, набор красок, реактивов для окраски бактериальных спор и капсул, готовые мазки капсулообразующих бактерий, пробиркой со спорообразующей культурой, суточные культуры подвижных бактерий, демонстрационные плакаты по теме занятия (Метод Пешкова, Метод Златогорова, Метод Ольта, Метод Михина, Споры и капсулы возбудителя сибирской язвы, Методы определения подвижности бактерий, Жгутики бактерий).

Теоретический материал

Специальные методы окраски микробов основаны на особенностях физико-химического строения бактериальных клеток, спор, капсул. Эти методы окраски применяются для дифференциации микроорганизмов и изучения их клеточной структуры.

Спорообразование – это стадия покоя в жизненном цикле клетки, связана с неблагоприятным действием окружающей среды. Спорообразование характерно для 15 родов бактерий. Процесс образования эндоспор сложный и проходит несколько этапов. В клетке прекращаются восстановительные процессы, завершается репликация ДНК и заменяется метаболизм.

Сердцевина споры содержит рибосомы, различные ферменты, липиды. Центральную часть спор составляют белки и нуклеиновые кислоты. Она окружена ЦПМ, к которой прилегают зачаточный слой и далее мощный слой кортекоа. Снаружи спора одета многослойными покровами, их не менее трех: внутренний, средний, внешний. Покровы образованы белком с небольшой добавкой углеводов и липидов, который обеспечивает устойчивость ее к действию различных ферментов. В течение первых пяти часов спорообразования значительная часть белков материнской клетки распадается. При этом образуется специфическое для спор вещество – дипиколиновая кислота, В ходе синтеза дипиколиновой кислоты происходит поглощение ионов кальция. В зрелых спорах эта кислота составляет 10-15% сухого вещества.

В состоянии спор микрорганизмы обладают весьма высокой устойчивостью к действию высокой температуры, разного рода излучений и химических агентов. Терморезистентность обусловлена очень низким содержанием воды и приблизительно пропорциональна содержанию в ней дипиколиновой кислоты. Химическая устойчивость обусловлена непроницаемостью оболочки для многих веществ. Зрелые споры не проявляют никакой метаболической активности. У большинства бактерий споры заключены в экзоспориум (образование в виде свободного мешка).

Для выявления спор применяют специальные методы окраски. Они основаны на том, что перед окрашиванием оболочка клетки подвергается разрушению путем протравливания какой-либо кислотой (серной, соляной, карболовой, хромовой кислотами) при подогревании на пламени спиртовки. Одним из простых способов окраски является метод Златогорова.

Окраска спор по Златогорову. На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, наносят карболовый фуксин, подогревают 5-10 мин. до отхождения паров (можно накладывать на мазок заранее окрашенные бумажки, нанести 3-5 капель воды и подогревать). Мазок обесцвечивают 3 %-ным раствором серной кислоты (соляной кислоты) 5-10 с, промывают водой, дополнительно окрашивают раствором метиленовой сини 2-5 мин. Промывают водой, высушивают, микроскопируют под иммерсией. Микрокартина: споры - красные, вегетативные клетки-синие.

Окраска спор по Пешкову. На подготовленный препарат наливают щелочной раствор метиленовой сини и кипятят 15-20 с. Смывают синь водой и дополнительно окрашивают 0,5 %-ным водным раствором нейтральрота 30 с. Промывают водой, высушивают и микроскопируют под иммерсией. Микрокартина: споры - синие или голубые, вегетативные клетки - розовые.

К спорообразующим бактериям относят: возбудителя сибирской язвы, возбудителей анаэробных инфекций (столбняка, ботулизма, брадзота, энтеротоксемии, дизентерии ягнят, злокачественного отека).

Капсула имеет многослойную фибриллярную структуру. Фибриллы определенных слоев располагаются параллельно или перпендикулярно по отношению к клеточной стенке. Основным химическим компонентом данной структуры являются полисахариды гомо-и гетерополимерной природы. Капсула некоторых видов бактерий состоят из полипептидов. Основная функция, капсулы - защитная. Она предохраняет клетку от действия различного рода неблагоприятных факторов внешней среды. У патогенных микроорганизмов наличие капсулы обычно сопряжено с высокой вирулентностью штамма, что связано с антифагоцитарной активностью капсулы. Капсула обеспечивает адгезию на различных субстратах, может содержать запасы питательных веществ. Утрата капсулы часто ведет к потере вирулентных свойств микроба. Для дифференциального окрашивания и обнаружения капсул микроорганизмов используют специальные методы.

Одним из простых и распространенных способов окраски капсул являются методы Михина и Ольта.

Окраска капсул по Михину. На фиксированный препарат наносят метиленовую синь и красят его в течение 3 мин. при подогревании, краску сливают и промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией.

Микрокартина: капсулы - бледнорозовые, тела клетки - синего цвета.

Окраска капсул по Ольту. Фиксированный мазок окрашивают свежеприготовленным 2-3 %-ным водным раствором сафранина в течение 1-3 мин. с последующим быстрым смыванием краски водой, высушивают наносят иммерсионное масло и микроскопируют.

Микрокартина: капсулы - бледно-желтые, тела бактерий - коричневые.

К капсулообразующим бактериям относят: возбудителей сибирской язвы, диплококковой инфекции, некоторых анаэробных инфекций.

Для прижизненных наблюдений наиболее часто готовят препараты «раздавленная капля» или «висячая капля».

Работу проводят в следующем порядке:

1) приготовить предметное и покровное стекла;

2) зажечь спиртовку;

3) взять пробирку со стерильной водой в левую руку и поместить её наклонно между большим и указательным пальцем на расстоянии 3–5 см от пламени;

4) в правую руку взять петлю, простерилизовать ее в пламени спиртовки, включая часть петледержателя, которая при работе помещается в пробирку;

5) мизинцем правой руки зажать пробку пробирки, повернуть, вынуть ее и держать, не касаясь окружающих предметов;

6) обжечь края пробирки и взять петлей каплю воды, поместить её на предметное стекло;

7) обжечь края пробирки и пробку, закрыть пробирку и поставить в штатив;

8) прожечь петлю;

9) открыть пробирку с культурой так же, как в п. 5;

10) стерильную петлю ввести в пробирку с культурой, охладить, прикоснувшись к внутренней поверхности пробирки, а затем взять ею небольшое количество микроорганизмов;

11) петлей с микроорганизмами сделать штрих на стекле внутри капли воды. После этого петлю прожечь и охладить, прикоснувшись к стеклу;

12) растереть штрих петлей круговыми движениями, чтобы получилась слегка опалесцирущая суспензия;

13) петлю прожечь;

14) полученную суспензию микроорганизмов накрыть покровным стеклом и микроскопировать.

Чтобы в поле зрения не было пузырьков воздуха, нужно, расположив покровное стекло под углом 40–45°, прикоснуться им к краю капли и, когда она распределится вдоль грани, осторожно накрыть каплю. Препарат можно подкрасить метиленовым синим (в концентрации 0,01–0,001), капнув непосредственно в препарат или поместив каплю красителя у края покровного стекла, с противоположной стороны – полоску фильтровальной бумаги. При изготовлении препарата нужно учитывать размер капли, который должен быть равен приблизительно объему двух рисовых зерен. Маленькая капля быстро высыхает, при большой покровное стекло плавает на поверхности капли, что мешает качественному изображению объекта при микроскопировании.

Висячая капля. На середину необезжиренного покровного стекла наносят очень маленькую, с четкими краями каплю суспензии микроорганизмов, как описано выше. Каплю материала покрывают предметным стеклом с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло с прилипшим к нему покровным стеклом переворачивают. Капля оказывается висячей в герметически закрытой влажной камере, из которой жидкость испаряется очень медленно, и поэтому препарат долгое время остается пригодным для наблюдения. Висячую каплю микроскопируют с плоским зеркалом и суженной диафрагмой.

Практическое задание 1: Изучить теоретический материал теме занятия.

Этапы выполнения задания:

1 Изучить методы обнаружения спор и капсул, определения подвижности бактерий.

2 Усвоить методы окраски мазков-препаратов Пешкова, Златогорова, Михина, Ольта, «висячоя», «раздавленная» капля.

3 Законспектировать теоретический материал по теме занятия.

Практическое задание 2: Определить наличие спорообразования у исследуемых культур.

Этапы выполнения задания:

1 Приготовить мазки-препараты из музейных микробных культур (№ 1, 2), окрасить их методами Пешкова и Златогорова.

2 Выяснить наличие спорообразования у исследуемых культур.

3 Зарисовать обнаруженные микроорганизмы в тетрадь, определить наличие, расположение, размер эндоспор и отчитаться преподавателю.

Практическое задание 3: Определить наличие капсулы у исследуемых культур.

Этапы выполнения задания:

1 Приготовить мазки-препараты из музейных микробных культур (№ 1, 2), окрасить их методами Ольта и Михина.

2 Выяснить наличие капсулы у исследуемых культур.

3Изучить готовый (музейный) препарат капсулообразующих бактерий.

3 Зарисовать обнаруженные микроорганизмы в тетрадь, определить наличие, расположение капсулы и отчитаться преподавателю.

Практическое задание 4: Определить подвижность суточной микробной культуры.

Этапы выполнения задания:

1 Приготовить препараты «висячая», «раздавленная капля», провести посев в полужидкую среду музейной микробной культуры (№ 3).

2 Выяснить наличие жгутиков у исследуемой культуры.

3 Зарисовать обнаруженные микроорганизмы в тетрадь и отчитаться преподавателю.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Что такое споры бактерий? 2 Чем объясняется большая устойчивость спор в сравнении с вегетативной формой бактерии? 3 В чем заключается биологическое отличие спор бактерий от спор грибов? 4 Назовите некоторые виды спорообразующих бактерий. 5 На чем основаны методы окраски спор. 6 Что такое капсула, ее происхождение и значение? 7Поясните химическую структуру капсулы и условия капсулообразования. 8 Назовите виды капсулообразующих бактерий. 9 Назовите методы окраски капсул, в чем их сущность? 10 Перечислите методы окраски спор. 11 Поясните технику и сущность окраски капсул по Ольту, по Михину. 12 Как приготовить препараты «раздавленная капля», «висячая капля?»?

План

1. Морфология и классификация плесневых грибов и дрожжей.

2. Методы изучения морфологических особенностей грибов.

3. Микроскопический метод изучения морфологии дрожжей

Материальное обеспечение: культуры микроскопических грибов, дрожжей, инструменты для приготовления препаратов для микроскопии, пробирки со стерильным физ. раствором, раствором глицерина, набор красок и реактивов для микроскопического исследования, микроскопы, бинокулярная лупа, демонстрационные плакаты «Морфология микроскопических грибов», «Плесневые грибы и дрожжи».

Теоретический материал

Царство грибов (Fungi, Mycetes) сочетает свойства, как растений, так и животных. Общие признаки грибов и растений: неподвижность, верхушечный рост и размножение с помощью спор. Вместе с тем у грибов, как и у животных, отсутствует фотосинтез, в продуктах обмена присутствует мочевина, а в плотных оболочках клеток имеется хитин. Грибы являются гетеротрофами: сапротрофами, паразитами, редко хищниками. Благодаря тому, что мицелий представляет систему ветвящихся гифов, обеспечивается большая поверхность для осмотрофного типа питания. При этом происходит выделение ферментов и осмотическое всасывание органических веществ.

Роль грибов неоднозначна. Микромицеты вызывают порчу пищевых продуктов. Портят смазочные масла и другие нефтепродукты, оптические изделия, лакокрасочные покрытия, вызывают коррозию металлов. Грибы разрушают книги, произведения искусства и т. п. Однако значительное число грибов – полезные. Около 150 видов грибов – съедобные и используются в питании. Грибы из рода Penicillium и Aspergillus являются источником получения большого количества антибиотиков (пенициллин, гризеофульвин). В медицине широко применяют препараты из склероциев спорыньи. Из грибов получают витамины, стероидные препараты, ферменты, используемые в текстильной, кожевенной, винодельческой и других видах промышленности. Основная масса грибов – аэробы. Многие виды грибов вызывают различные типы брожения, например спиртовое, вызываемое дрожжевыми и некоторыми мукоровыми грибами, или брожение с образованием органических кислот – лимонной, щавелевой и др.

Техника микроскопирования мицелиальных грибов Молодые 3–4-суточные колонии грибов, выращенные на среде сусло-агар или Чапек-агар, можно рассматривать непосредственно в чашках Петри. При этом не нарушается строение органов спороношения, которые хорошо различимы даже при микроскопировании с объективом ×8. Для более детального знакомства с особенностями строения разных видов грибов готовят препараты «раздавленная капля». Для этой цели двумя препаровальными иглами, предварительно профламбированными в пламени горелки, отделяют от питательной среды часть грибной колонии и помещают её в каплю воды и глицерина (1:4). На предметном стекле плёнку расправляют и накрывают препарат покровным стеклом. При изготовлении препарата мукоровых грибов иглами захватывают только воздушный мицелий, не касаясь питательной среды. Аккуратно переносят кусочек мицелия в каплю смеси и накрывают покровным стеклом. Предметные стекла подогревают до легкого закипания воды.

При определении видовой принадлежности грибов родов Penicillium и Aspergillus пользуются препаратами, приготовленными в капле смеси глицерина с водой, рассматривая их с объективом ×40. На таком препарате можно рассмотреть сторму вздутия на конце конидиеносца у грибов рода Aspergillus, строение метелки грибов рода Penicillium, характер расположения фиалид и другие признаки. Применяя иммерсию (объектив ×90), можно исследовать еще более мелкие детали строения разных видов грибов. Изучение органов спороношения у грибов рода Fusarium целесообразно проводить, пользуясь методом микрокультур, так как грибы этого рода дают хорошее спороношение в условиях истощения питательного субстрата.

При изучении морфологии дрожжей следует учитывать, что в зависимости от условий выращивания продолжительность их развития и активность размножения их может меняться. Интенсивное размножение характерно для молодых дрожжей (12–16-часовая культура), у зрелых (24–48-часовая культура) процесс почкования замедляется. При наблюдении зрелых дрожжей в поле зрения микроскопа попадают 2–4 % мертвых клеток. Мертвые клетки выявляются с помощью окрашивания метиленовой синью. Раствор метиленовой сини проникает только через оболочки мертвых клеток, в результате чего последние окрашиваются в интенсивно голубой цвет, тогда как живые клетки остаются бесцветными.

Для изучения морфологии дрожжей рекомендуется использовать чистые культуры, выращенные на жидком 6–7 %-м сусле по Баллингу или на сусло-агаре (СА). Форму и размеры вегетативных клеток, характер вегетативного размножения наблюдают на 24–48–часовых культурах. Из культур дрожжей готовят прижизненные препараты в капле воды и микроскопируют их, пользуясь объективом ×40.

Способность дрожжей к спорообразованию выясняют на 5–10– суточных культурах, выращенных на плотной среде. Однако у некоторых дрожжей способность к спорообразованию установить трудно. Проверить способность дрожжей к спорообразованию можно при переносе культуры на субстрат, не содержащий питательных веществ, где вегетативное размножение дрожжевых клеток будет исключено. В качестве такого субстрата можно рекомендовать пластинки голодного агара. На них высевают взвесь культуры дрожжей из жидкого сусла и выращивают в термостате при 22–25 °С. Из материала, культивируемого на признак спорообразования дрожжей, готовят прижизненные препараты и микроскопируют их, пользуясь объективом ×40. Просматривая препараты, прежде всего обращают внимание на способ спорообразования (из зигот или вегетативных клеток) и на форму опор (шаровидные, овальные, бобовидные и т. д.). Как правило, дрожжевые клетки содержат значительное количество разнообразных запасных компонентов: волютиновые зерна, гранулёзу, гликоген, жировые включения. Для выявления этих включений пользуются окраской фиксированных препаратов по методу Муромцева. Готовят фиксированный мазок, затем окрашивают его в течение 1 минуты краской по Муромцеву, которая содержит раствор фуксина основного 0,16 г, спирт этиловый 96 %-й 20 мл, воду дистиллированную 200 мл. На препарате зёрна волютина должны быть окрашены в фиолетовый цвет, цитоплазма – в голубой.

Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания.

Практическое задание 1: Ознакомиться с характерными особенностями строения мицелия и органов спороношения грибов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Fusarium.

Этапы выполнения задания:

1 Микроскопировать колонии грибов непосредственно в чашках Петри при малом увеличении (объектив ×8, ×20). Зарисовать общий вид.

2 Ознакомиться с органами спороношения грибов в микрокультуре.

3 Приготовить прижизненные препараты грибов в капле смеси глицерина с водой. Изучить приготовленные препараты с объективом ×8 (общую картину строения) и отметить участок, наиболее четко отражающий характер спороношения данного гриба, поставить объектив ×40 и при этом увеличении зарисовать гифы, органы спороношения и споры, отчитаться преподавателю.

Практическое задание 2: Ознакомиться с характерными особенностями строения дрожжевых грибов.

Этапы выполнения задания:

1 Из культуры дрожжей рода Saccharomyces приготовить препарат типа «раздавленная капля». Микроскопировать препарат с объективом ×40. Рассмотреть и зарисовать форму клеток и их строение: цитоплазму, вакуоли и включения запасных питательных веществ. Цитоплазма обнаруживается при микроскопировании как более темная зернистая масса, вакуоли имеют вид светлых просвечивающихся пятнышек. Капли жира светлые, блестящие благодаря сильному преломлению света; включения имеют вид плотных зернышек. Найти и зарисовать почкующиеся клетки.

2 Окрасить препарат раствором метиленовой сини до темно-голубого цвета. Отметить наличие живых (почкующихся) клеток и окрашенных в синий цвет (мертвых).

3 Из материала, культивированного на признак спорообразования дрожжей, приготовить препарат и микроскопировать. Отметить способ спорообразования, форму спор. Зарисовать.

4 Приготовить фиксированные препараты дрожжей и окрасить их краской по Муромцеву. Микроскопировать с иммерсионным объективом, отметить цвет зерен волютина и цитоплазмы.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Как рассматривается современное систематическое положение грибов в мире живых существ? 2 Какие основные таксономические критерии используются для классификации грибов? 3 Какие способы размножения известны у грибов? 4 Какие фитопатогенные грибы имеют важное экономическое значение? 5 Какие типы питания встречаются у грибов? 6 Какими признаками характеризуются роды Penicillium и Aspergillus? 7 В чем заключаются особенности морфологического строения дрожжевых грибов? 8 Какими способами осуществляется размножение у дрожжевых грибов? 9 Какими признаками характеризуются аскомицетовые дрожжи? 10 Какие дрожжевые грибы широко используются в пищевой промышленности? 11 Какими признаками характеризуются аспорогенные дрожжи? 12 Имеются ли среди дрожжевых грибов патогенные для человека виды? Какие заболевания они вызывают? 13 Какие промышленно важные биологически активные вещества образуют дрожжи? 14 Какое значение в природе имеют дрожжевые грибы? 15 Как дрожжи используются в хозяйственной деятельности человека?

План

1. Изучить методические указания к занятию № 5.

2. Изучить классификацию питательных сред, требования, предъявляемые к питательным средам, понятие и методы стерилизации, применяемые в лаборатории, отчитаться преподавателю о проделанной работе.

Материальное обеспечение: набор сухих питательных сред (любых) в заводской упаковке – 6-7 единиц, готовые питательные среды в пробирках и чашках Петри (МПА, МПБ, агар Сабуро, солевой агар, Китта-Тароцци, Кесслер, Левенштейна-Йенсена и др.), в чашках Петри: пептон, ΝaCl, агар – агар, чистая сухая колба на 250 мл с ватно-марлевой пробкой – 2 штуки, дистиллированная вода – 300 мл, мерная колба или цилиндр на 100 мл, весы электрические, фильтровальная бумага, чистая стеклянная лабораторная посуда (пробирки, пипетки, колбы, цилиндры), стерилизатор с инструментами, стерильные пастеровские пипетки, бикс, маркер, газетная бумага для завертывания посуды, фильтры (асбестовые – разного диаметра, керамические - Шамберлана, мембранные), вату, нитки, марлю, бинт.

Теоретический материал

Питательные среды применяют для получения чистых культур микроорганизмов, изучения их морфологических и физиологических свойств, накопления больших количеств микробов в лабораторных условиях.

Классификация питательных сред:

по происхождению: естественные (натуральные) и искусственные (синтетические).

Естественные среды состоят из продуктов животного и растительного происхождения, имеют сложный и непостоянный состав. Искусственные среды имеют в составе определенные химические органические и неорганические соединения в точно указанных концентрациях.

по составу: белковые, безбелковые, минеральные.

по консистенции: жидкие (МПБ), полужидкие (МПЖ, ПЖА), плотные (МПА).

Для придания плотности в питательные среды добавляют агар-агар (высушенные морские водоросли).

по назначению: обычные, специальные, элективные, дифференциально-диагностические.

Обычные среды применяют для выращивания большинства микроорганизмов, к ним относятся МПА, МПБ, МПЖ.

Специальные среды применяют для выделения и культивирования определенных групп или видов микробов. Например, солевой агар – для стафилококков; агар Сабуро, Чапека, сусло-агар – для микроскопических грибов; среда Омелянского – для выделения возбудителей анаэробного разложения клетчатки.

Элективные (избирательные) среды пригодны для развития одного вида микробов или группы родственных микроорганизмов. Например, среда Кесслер – для выделения бактерий группы кишечной палочки (БГКП), среда Левенштейна-Йенсена – для выделения возбудителей туберкулеза, среда Любашенко, Терских – для выделения лептоспир.

Дифференциально-диагностические среды применяют для изучения биохимических свойств микробов и выделения чистых культур некоторых микробов. Например, среды Гисса с углеводами, плотные среды с индикаторами – Эндо, Левина, Плоскирева и др.

Требования, предъявляемые к питательным средам:

содержать необходимые для микробов питательные вещества: источники азота, углерода, кислорода и водорода, неорганические вещества, факторы роста;
быть влажной, т.к. микробы усваивают только растворенные питательные вещества;
быть стерильной, не содержать никаких микроорганизмов;
быть прозрачной, чтобы можно было изучать культуральные свойства микробов;
иметь определенную рН среды (7,0-7,4 - для большинства бактерий; 6,8 – для микроскопических грибов и т.д.).

Контроль стерильности питательных сред. Подготовленные для посева среды в пробирках, чашках Петри помещают в термостат на 24 часа при 37ºС. При отсутствии признаков роста, среду признают стерильной, и используют для посева.

Контроль ростовых качеств питательных сред. Из подготовленной партии питательной среды берут 2-3 пробирки, (чашки Петри), высевают на них соответствующие музейные культуры и выдерживают в термостате необходимое для роста данного микроорганизма время. При обнаружении характерного роста среду признают пригодной к использованию.

Хранение питательных сред. Питательные среды хранят в холодильнике при температуре +4 +6 ºС или в шкафу при комнатной температуре, не допуская высушивания среды. Для работы лучше использовать свежеприготовленные среды, поэтому длительное хранение сред не допускается.

Приготовление питательных сред в настоящее время не представляет особых трудностей в связи с тем, что промышленность выпускает сухие полуфабрикаты питательных сред, сбалансированные по всем необходимым для культивирования микроорганизмов веществам. Однако можно приготовить питательные среды и из отдельных компонентов.

Мясо - пептонный бульон (МПБ). В начале готовят мясную воду. Для этого берут 500 г нежирной говядины без костей и сухожилий. Пропускают через мясорубку. Заливают 1 литром воды и настаивают сутки в холодильнике. Затем фарш отжимают через марлю и кипятят на слабом огне в течение часа. Фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам. Стерилизуют 30минут при температуре 120 градусов в автоклаве. Хранят в холодильнике.

К 1 л мясной воды прибавляют 1% пептона, 0,5% поваренной соли и кипятят 10 мин. Определяют рН (доводят её до 7,6-7,7) фильтруют, разливают по пробиркам, автоклавируют.

Мясо - пептонный агар (МПА - плотная питательная среда). К МПБ добавляют 2 проц. агар-агара и кипятят до его расплавления, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробиркам и автоклавируют. Скашивают его горячим под углом 5-6°.

Мясо-пептонный полужидкий агар (МПЖА) готовят также, как и МПА, но агар-агара добавляют от 0,15 до 0,25%.

Определение рН питательных сред. Производится с помощью рН -метра или компаратора Михаэлиса. В компараторе имеется набор цветных стандартных растворов из мета и паранитрофенола, интенсивность окраски которых соответствует реакции жидкости в пробирке от 5,4 до 8,6 (интервалы 0,2).

Определение рН производится в специальном штативе, в гнезда которого вставляют пробирки в следующем порядке:

№ I и 3 - пробирки с 2 мл бульона и добавляют 5 мл дистиллированной воды;

№ 2 - 2 мл бульона, 4 мл дистиллированной воды и 1 мл индикатора;

№ 4 - стандарты;

№ 5- 5-7мл дистилированной воды

Пробирки рассматривают на свет через нижнее боковое отверстие, сравнивают цвет испытуемого бульона (пробирка № 2) со стандартами. Если цвет не совпадает с нужным стандартом, то в эту пробирку добавляют из градуированной пипетки раствор щелочи, пока цвет ее не сравняется со стандартной. Количество добавленной щелочи на 2 мл бульона пересчитывают на весь объем приготовленной среды, отмеряют и добавляют к ней раствор щелочи. При исследовании мутных жидкостей в компаратор вставляют матовый светофильтр, а окрашенных в желтый цвет - синий светофильтр.

Стерилизация (лат. sterilis — бесплодие, обеспложивание) — процесс, вызывающий гибель патогенных и непатогенных микроорганизмов и их форм (вегетативных и споровых) в каком-либо материале. В бактериологических лабораториях стерилизуют питательные среды, стеклянную посуду (пипетки, пробирки, чашки Петри и др.), инструменты, ватные и марлевые тампоны и др. Для специальных условий асептической работы стерилизуют воздух и необходимые предметы в боксах. Для стерилизации используют физические и химические методы.

ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ включают:

1) стерилизацию сухим жаром (фламбирование, сухим нагретым воздухом),

2) стерилизацию влажным жаром (кипячение, текучим паром при 100 °С, дробная стерилизация при температуре ниже 100 °С, стерилизация паром под давлением с температурой выше 100 °С, пастеризация),

3) стерилизацию фильтрованием (бактериологические фильтры),

4) ультрафиолетовыми лучами,

5) ультразвуком.

Методы стерилизации сухим жаром.

Фламбированием, или прокаливанием, стерилизуют обычно бактериологические петли, пинцеты и другие металлические предметы.

Стерилизация сухим нагретым воздухом осуществляется в специальных сушильных шкафах с двойными стенками. Снаружи шкаф облицован теплонепроницаемым материалом, внутри - стенки металлические. В верхней части шкафа находится термометр. Между теплонепроницаемой обшивкой и внутренним металлическим шкафом на дне имеется автоматический электронагревательный элемент. В сушильном шкафу стерилизуют чистую стеклянную посуду. Колбы закрывают ватными пробками, накрывают бумажными колпачками и завязывают. Чашки Петри и пастеровские пипетки завертывают пачками в пергаментную бумагу. Режим стерилизации — при температуре 155—160 °С, экспозиция 2 ч, при 165— 170 °С — 1—1,5 ч, при 180 °С — 1ч. По истечении времени стерилизации нагревание прекращают и, лишь когда температура снизится примерно до 45 °С, шкаф открывают. Воспламеняющиеся вещества, питательные среды, резиновые предметы стерилизовать сухим жаром нельзя.

Методы стерилизации влажным жаром.

Кипячение — общепринятый метод стерилизации инструментов (шприцы, иглы, пинцеты, ножницы, скальпели и др.) и некоторых резиновых и стеклянных предметов, которые раскладывают в специальных закрывающихся металлических ванночках — стерилизаторах, имеющих вставную решетку — подставку. Эту подставку выстилают 2—3 слоями марли или тонким слоем гигроскопической ваты. Шприцы стерилизуют в разобранном виде, в иглы вставляют мандрены. Режущие инструменты — лезвия скальпелей, ножниц — рекомендуется обертывать марлей или ватой. В стерилизатор наливают воду (лучше дистиллированную) так, чтобы она полностью покрывала инструменты, и добавляют 2 %-ный гидрокарбонат Na. Стерилизатор закрывают крышкой. Кипятят 20—30 мин. После стерилизации воду осторожно сливают, а инструменты используют только после их охлаждения.

Стерилизация текучим паром — в основу этого метода положен способ дробной стерилизации (разработанный Тиндалем, 1877) при разных температурных режимах не выше 100 °С. Осуществляют стерилизацию в текучепаровом аппарате Коха при 100 °С 30—40 минут. Аппарат Коха представляет собой одностенный металлический котел цилиндрической формы с двойным дном, закрывающийся крышкой с отверстием для термометра и выхода пара. Внутри котла имеются специальная подставка с отверстиями для стерилизуемого материала и нагревательные элементы. На дно аппарата наливают воду. Началом стерилизации считают момент закипания воды. Образуемый пар устремляется вверх непрерывной струей, соприкасаясь с обрабатываемым материалом. Стерилизацию проводят 3 дня подряд. Однократное прогревание убивает только вегетативные формы микроорганизмов. Оставшиеся жизнеспособными споры бацилл в периоды между стерилизацией прорастают в вегетативные формы. Стерилизация на следующий день вызывает их гибель. На третий день прогревание гарантирует полное обеспложивание материала. Текучим паром стерилизуют питательные среды (и другие материалы), которые разрушаются при нагревании их выше 100 °С (желатина, углеводы).

Тиндализация — дробная стерилизация при температурах ниже 100ºС. Стерилизацию осуществляют в водяной бане. Принцип этого метода тот же, что и при стерилизации текучим паром. Кратность прогрева зависит от применяемых температур: при 70—80 °С в течение 3 дней, 60—65 °С — 5 дней, 56—58 °С — в течение 6—7 дней. В первый день материалы стерилизуют 2 ч, в последующие дни — по одному часу. В промежутках между прогреваниями стерилизуемый материал выдерживают при комнатной температуре для прорастания спор. Тиндализации при 56—58 °С подвергают материалы, разрушающиеся при более высокой температуре (коллоидные растворы, сыворотка крови и др.), белок содержащие вещества.

Автоклавирование — стерилизация паром под давлением с высокой температурой, осуществляют в специальном аппарате — автоклаве. В основе этого метода лежит нагревание помещенного в автоклав материала, герметически закрытого крышкой, чистым насыщенным паром под давлением выше атмосферного. При встрече насыщенного пара с более холодным объектом пар конденсируется, превращаясь в воду, в результате чего выделяется большое количество тепла и температура стерилизуемого объекта быстро повышается. Кроме того, при конденсации пара происходит уменьшение его объема, что способствует проникновению пара во внутренние части стерилизуемого материала. Современные автоклавы электрические; промышленность выпускает автоклавы вертикальные и горизонтальные.

Манометр показывает давление пара без учета окружающего атмосферного давления (760 мм рт. ст.). По истечении времени стерилизации автоклав отключают. После остывания при нулевом показании манометра открывают кран для спуска пара. Крышку открывают осторожно на себя, не заглядывая в котел, оберегая лицо, глаза от возможного остаточного пара. До полного выхода пара открывать крышку нельзя, так как при быстром падении давления внутри автоклава стерилизуемые жидкие среды закипают, пробки из пробирок выталкиваются вместе с жидкостью.

В автоклаве стерилизуют питательные среды, выдерживающие нагревание выше 100 °С (МПА, МПБ, физ.раствор), стеклянную посуду, завернутую в бумагу, перевязочный материал, халаты, заложенные в металлические биксы. Кроме того, в автоклаве обеззараживают использованные бактериальные культуры, посуду. В этих случаях давление пара и экспозиция стерилизации должны быть продолжительнее (1,5 атм — 1 ч), чем при стерилизации чистого материала (0,5 атм — 30—40 мин.).

Пастеризация — метод, предложенный Пастером с целью сохранения питательной ценности пищевого продукта (молоко, мясные, рыбные и овощные консервы), которая снижается при кипячении (разрушаются витамины и другие нестойкие к действию высокой температуры вещества). При пастеризации продукт нагревают до 80 °С 30 мин, затем резко охлаждают (до 4—8 °С). Пастеризацией достигается частичная стерилизация — погибают вегетативные формы бактерий, а споры сохраняются. Резкое охлаждение и последующее хранение при низкой температуре (4—5 °С) препятствуют прорастанию спор и последующему размножению бактерий.

Стерилизация фильтрованием заключается в пропускании жидкого материала через бактериологические фильтры путем создания на фильтре перепада давления приложением повышенного давления к жидкости, находящейся над фильтром, либо путем создания вакуума в приемнике фильтрата. Действие фильтра состоит в механической задержке и в адсорбции микроорганизмов стенками пор фильтра. Размеры микробов часто бывают меньше среднего диаметра пор фильтров. Фильтруют обычно жидкости, не выдерживающие нагревание (сыворотки крови, растворы антибиотиков и др.). Фильтры бывают: твердые — керамические (цилиндрической формы в виде «свечей»), асбестовые (в виде пластинок), мембранные (с наиболее точной калибровкой пор).

Керамические фильтры (Шамберляна, Беркефельда, Ф₂, СФ) изготавливают из смеси каолина, кварцевого песка. Более широкое применение нашли фильтры Зейтца — плотные пластины, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой.

Мембранные фильтры (ультрафильтры), или коллодийные мембраны, представляют собой тончайшие листки из гемицеллюлозы, обработанной соответствующими реактивами, температурой под прессом. Эти фильтры различают по диаметру и величине пор. Используют их для фильтрации, концентрации частиц, содержащихся в фильтруемом материале, а также для определения величины вирусных частиц.

Большей частью в работе используют фильтры Зейтца и мембранные фильтры, вмонтированные в специальном держателе-воронке, вставленном в пробку, закрывающую колбу Бунзена (толстостенная колба с тубусом). Стерильность полученных фильтратов проверяют посевом на питательные среды с последующим инкубированием в термостате в течение нескольких дней.

Стерилизация ультрафиолетовыми лучами. В лаборатории источником УФ-облучения обычно служат специальные бактерицидные лампы. Используют эти лучи для обеззараживания воздуха в помещениях (боксах, операционных). Бактерицидные лампы нашли также свое применение в пищевой промышленности при хранений различных продуктов (температура выше 0 °С).

Ультразвук, являясь физическим стерилизующим фактором, может быть использован, например, для обеззараживания воды, молока, некоторых продуктов, кожевенного сырья. Стерилизующее действие ультразвука связано с разрушением внутренних структур бактериальной клетки.

ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ стерилизации в лабораторной практике имеют ограниченное применение. Химические вещества (соли металлов, щелочи, антибиотики и др.) применяют для консервирования, с целью предупреждения бактериального загрязнения питательных сред, вакцин, а также лечебных и диагностических сывороток.

Питательные среды консервируют хлороформом, толуолом, иногда эфиром (для освобождения от консерванта среду нагревают до 56 °С).

Вакцины и лечебные сыворотки консервируют фенолом (0,25—0,5 %-ным), хлороформом (0,5%-ным), формалином (0,05%-ным) или мертиолатом (в конечной концентрации 1 : 5000—1 : 10 000).

Для консервирования агглютинирующих сывороток используют борную кислоту, толуол или глицерин.

Химические вещества применяют в лабораториях и для дезинфекции, которая направлена на уничтожение только патогенных микроорганизмов в окружающей среде.

Практическое задание 1: Изучить теоретический материал теме занятия.

Этапы выполнения задания:

1 Изучить классификацию питательных сред по происхождению, по назначению, по консистенции и др.

2 Усвоить требования, предъявляемые к питательным средам, методы стерилизации питательных сред.

3 Усвоить понятие и методы стерилизации, применяемые в бактериологической лаборатории.

4 Законспектировать теоретический материал по теме занятия.

Практическое задание 2: Приготовить питательные среды.

Этапы выполнения задания:

1 Определить и взвесить необходимое количество компонентов для приготовления 100 мл МПБ, 100 мл МПА.

2 Смешать необходимые компоненты в колбе, сварить среды, определить рН среды и подготовить их для стерилизации.

3 Расчеты компонентов среды представить преподавателю и отчитаться о проделанной работе.

Практическое задание 3: Подготовить стеклянную лабораторную посуду к стерилизации.

Этапы выполнения задания:

1 Определить чистоту лабораторной посуды и ее пригодность к стерилизации.

2 Завернуть чашки Петри, мерные пипетки, подобрать ватно-марлевые пробки к колбам, пробиркам.

3 Подготовленную к стерилизации посуду представить преподавателю, при одобрении выполненной работы разместить подготовленную посуду в сушильный шкаф под контролем лаборанта.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Поясните отличие понятий «стерилизация» и «дезинфекция». 2 Перечислите виды питательных сред по назначению. 3 На какие группы делят питательные среды по составу? 4 Поясните технику изготовления плотных питательных сред. 5 Каким требованиям должны соответствовать питательные среды? 6 Какие методы обеззараживания различных объектов применяют в микробиологической практике? 7 Какие значения рН являются оптимальными для выращивания бактерий, грибов, дрожжей? 8.Как определить показатель рН питательной среды?

План

1. Изучить методические указания к занятию № 6.

2. Провести посев микробных культур в питательные среды, отчитаться преподавателю о проделанной работе.

Материальное обеспечение: музейные культуры бактерий, стерильные питательные среды в пробирках – МПА и МПБ, в чашках Петри – МПА, набор инструментов для посева бактерий, стерильные Пастеровские пипетки, спиртовки, спички, микроскопы, наборы красок.

Теоретический материал

Одним из условий проведения посева микробов на питательные среды является стерильность. Она достигается путем проведения посевов в специальных комнатах (боксах) около зажженной спиртовки. Перед посевом воздух обезвреживают в течение 15 мин. ультрафиолетовыми лучами с помощью ртутно-кварцевой лампы ПРК-4.

Посев в жидкие питательные среды. Пробирку с чистой культурой и пробирку со стерильной питательной средой берут в левую руку и слегка наклоняют. В правую руку берут, как ручку или карандаш, бактериологическую петлю, держа ее вертикально, фламбируют над пламенем спиртовки. Обе ватные пробки захватывают мезинцем и мякотью ладони правой руки и безымянным пальцем, зажимают и держат их во время посева в таком положении, но ни в коем случае не кладут пробки на стол.

Обжигают края открытых пробирок в пламени горелки. Затем вводят стерильную бактериологическую петлю в пробирку с культурой в середину жидкости на жидких средах. Быстро, но осторожно, переносят петлю в пробирку со стерильной средой и смывают ее в жидких средах. Извлекают петлю, обжигают края пробирок, закрывают их обожженными пробками и фламбируют петлю.

В процессе работы необходимо учитывать следующее:

1)не допускать, чтобы жидкость питательной среды выливалась при горизонтальном положении пробирки;

2)следить, чтобы жидкость не смачивала края пробирки и ватных пробок;

3)при пересеве с жидкой среды на жидкую можно пользоваться, кроме петли, стерильной пастеровской или градуированной пипетками.

Капилляр пастеровской пипетки откалывают прокаленным пинцетом или пальцем, предварительно согнув над огнем и остудив край пипетки. Оба края пипетки слегка обжигают над пламенем спиртовки, после чего вносят в посевной материал. Посевной материал набирают в капилляр пипетки путем насасывания (в обратном конце пипетки должна быть вата), затем отверстие пипетки быстро и плотно зажимают указательным пальцем правой руки. Далее пипетку погружают в свежую питательную среду, куда и выдувают (выжимают при работе с грушей) ее содержимое. После посева пипетки сразу же погружаются в дезинфицирующий раствор (3 процентный раствор фенола). На другие жидкие среды посев проводят аналогичным образом.

Посев на плотные питательные среды

Посев на скошенный МПА. Методика посева в основном такая же, как и при посеве на жидкие среды, но при этом материал переносят петлей в пробирку с агаром не доходя до конца границы конденсационной воды, и зигзагообразными движениями распределяют материал по поверхности агара.

Посев в чашку Петри. При посеве на чашку ее устанавливают около горелки, фиксируют на столе левой рукой. Крышку поднимают большим и указательным пальцами настолько, чтобы в образующуюся щель свободно проходила петля или шпатель. Культуру из посевной пробирки захватывают петлей и штриховыми движениями распределяют по поверхности питательной среды. Можно каплю посевного материала нанести на поверхность МПА петлей или пипеткой, а потом растереть ее стерильным шпателем;

Пробирки и чашки с посевами помещают в термостат с температурой, оптимальной для определенного микроорганизма. Чашки в термостате размещают вверх дном, что предотвращает стекание конденсационной воды с крышки и размыв колоний. На другие плотные питательные среды посев проводят аналогичным образом.

Посев в мясо-пептонную желатину (МПЖ). На МПЖ посев производится уколом. Пробирку с МПЖ, застывшей в виде столбика, берут в левую руку, над пламенем спиртовки вынимают пробку и переворачивают вверх дном.

Затем петлю (в виде иглы) с культурой вкалывают снизу в центр столбика на всю его глубину . После этого петлю (иглу) извлекают, пробирку закрывают обожженной пробкой. Выращивание производится в условиях комнатной температуры (20—22°С) в течение 5—7 суток.

При бактериологическом исследовании некоторых материалов в лабораторной практической работе сталкиваются с наличием в них смеси бактерий двух или нескольких видов (в воде, молоке, воздухе, содержимом кишечника, гное и др.). Выделение из смеси одного вида микроба называют выделением чистой культуры. С этой целью специальными методами посевов достигается рост бактерий отдельными колониями (на плотных питательных). Пересев одной изолированной колонии в пробирку со стерильной питательной средой позволяет выделить чистую культуру (учитывая, что каждая колония развивается в результате размножения одной микробной клетки).

Рис 1 Посев на плотную среду.

Выделение чистой культуры. Один из первых методов был предложен Пастером — метод разведений, который состоит в том, что исследуемый материал последовательно разводят в жидкой питательной среде: берут ряд пробирок со стерильным МПБ (по 9—10 мл), исследуемый материал пипеткой вносят в первую пробирку, перемешивают, затем из нее небольшое количество (0,1 мл) переносят во вторую, после перемешивания — 6 третью и т. д. (иногда до 10 пробирок). Пастер полагал, что в последней пробирке возможен рост одного вида микроба, но это маловероятно, и в настоящее время метод разведений Пастера используют только как подсобный при других методах.

Метод Коха был разработан и предложен с применением плотной среды — желатиновые пластинки в чашках Петри. Но с введением в бактериологическую работу использования агар-агара желатиновые пластинки были заменены агаровыми. Суть метода Коха заключается в том, что, используя принцип Пастера, исследуемый материал разводят в 4—5 пробирках с расплавленным и остуженным до 45— 50°С МПА по 10—15 мл. Затем осторожно содержимое каждой пробирки выливают в стерильную чашку Петри и распределяют среду тонким слоем, чашку закрывают и, когда агар застынет (уплотнится), перевертывают вверх дном и помещают в термостат на 18, 20, 24 или 48 ч. В чашках на поверхности МПА вырастают колонии бактерий, но там, где концентрация микробов была меньше (больше степень разведения), вырастают изолированные друг от друга колонии. С обратной стороны (по дну чашки) карандашом по стеклу отмечают нужную колонию. Затем, приоткрыв крышку чашки, прикосновением бактериологической петли к одной (отмеченной) колонии, не касаясь других, осторожно берут небольшое количество микробной массы и переносят в пробирки со стерильными МПБ и МПА, последние помещают в термостат. Вырастает чистая культура.

Метод Дригальского — метод пластинчатого посева. Берут 4— 5 стерильных чашек Петри. Агаровую среду в колбе расплавляют на водяной бане, затем, вынув пробку, слегка прогревают края колбы и агар разливают в чашки Петри равномерным слоем (застывая, образуется агаровая пластинка). Закрытые крышкой чашки Петри оставляют на столе. После уплотнения среды чашки помещают в термостат для подсушивания вверх дном на 3—4 ч при 37—38 °С. Каплю исследуемого материала бактериологической петлей наносят на поверхность агара, шпателем Дригальского или соответственно изогнутой на пламени горелки пастеровской пипеткой каплю растирают равномерно на поверхности среды. Этим же шпателем, не обжигая его, растирают (засевают) по поверхности среды второй чашки, затем последовательно в третьей, четвертой чашках, после посева ихпомещают в термостат вверх дном. Рост изолированныхколоний обычно достигается в последних чашках. Далеепоступают, как и в первом случае: нужную колонию отмечают, отвивают в МПБ и МПА, помещают в термостат длякультивирования.

Для получения чистых культур пользуются и другими методами: нагреванием, добавлением к питательным средам (или к исследуемому материалу) химических веществ, биологическим методом (заражение лабораторных животных) и даже используют метод Шукевича. В случаях необходимости отделения споровых форм от неспорообразующих видов бактерий готовят взвесь исследуемого материала, прогревают ее в водяной бане при 80 °С 30—40 мин — вегетативные формы микроорганизмов погибают, споры сохраняются жизнеспособными. Далее поступают так, как это описано выше: прогретую взвесь высевают по методу Дригальского или Коха.

Химический метод заключается в том, что химические вещества в определенной концентрации добавляют к питательным средам. Действие этих веществ на разные виды микробов неодинаковое: одни виды погибают (бактерицидное действие), другие — задерживаются в своем росте (бактериостатическое действие), а на третьи эти вещества не оказывают губительного влияния. На этом принципе основано применение селективных и элективных сред.

Биологический метод позволяет выделить чистую культуру только патогенных (болезнетворных) микроорганизмов: исследуемый материал (суспензия ткани, взвесь бактерий) вводят восприимчивому животному (белая мышь, морская свинка, голубь, кролик). При наличии патогенного микроба в материале животные гибнут, их вскрывают, и посевы из внутренних органов обычно позволяют выделить чистую культуру.

Посев бактерий по методу Шукевича также позволяет выделить чистую культуру: подвижный микроб переходит на поверхность агара из конденсационной жидкости, из верхнего края выросшей культуры осторожно прикосновением петли берут микробную массу и проводят пересев, как и при других методах получения чистой культуры.

Получение чистой культуры анаэробов. Принцип сохраняется тот же, что и при работе с аэробами, только исполь зуют специальные среды: применяя метод Дригальского, посев проводят на глюкозно-кровяной агар в чашках Петри, которые затем помещают в условия анаэробиоза (в эксикатор, микроанаэростат). Пользуются также методом посева на среду Вильсона — Блера, когда вырастают отдельные черные колонии, их пересевают в среду Китта— Тароцци, получая таким образом чистую культуру. Этой же цели может служить биологическая проба: исследуемым материалом (или смешанной культурой) заражают восприимчивое лабораторное животное. После его гибели и вскрытия — посевы в среды Китта — Тароцци, полужидкий агар высоким столбиком или на глюкозо-кровяной агар, как упомянуто выше. Есть и другие способы, они изложены при описании отдельных видов анаэробов.

Практическое задание 1: Изучить теоретический материал теме занятия.

Этапы выполнения задания:

1 Изучить методы посева и выделения чистых микробных культур.

2 Усвоить методы посева микробных культур в жидкие и плотные питательные среды.

3 Усвоить методы выделения чистых культур микроорганизмов методам, основанными на получении изолировано растущих колоний и, основанных на биологических особенностях микроорганизмов.

4 Законспектировать теоретический материал по теме занятия.

Практическое задание 2: Освоить методы посева микроорганизмов в питательные среды.

Этапы выполнения задания:

1 Провести посев музейных культур в МПБ, МПА скос, МПА в чашки Петри штрихом.

2 Провести газонный посев музейных культур в МПА.

3 Поставить пробирки и чашки Петри с посевами в термостат, отчитаться преподавателю.

Практическое задание 3: Освоить методы выделения чистых культур микроорганизмов методом Дригальского.

Этапы выполнения задания:

1 Приготовить мазки-препараты из выросших на плотной среде колоний бактерий, окрасить их по Граму.

2 При микроскопическом исследовании определить необходимую для изоляции микробную культуру

3 Пересеять выбранную колонию по методу Дригальского, поместить посевы в термостат и отчитаться преподавателю.

Изучить технику посева микробов на плотные и жидкие питательные среды, методы культивирования в аэробных и анаэробных условиях Усвоить диагностическое значение выделения чистой культуры и освоить методы, применяемые для получения чистой культуры микроорганизмов.

Вопросы и задания для контроля знаний 1 На чем основан принцип получения чистой культуры по методу Коха, Дригальского? 2 В чем суть биологического метода выделения чистой культуры? 3 на чем основан химический метод получения чистой культуры? 4 Кто первым предложил метод получения чистой культуры микроорганизмов? 5 Какие методы применяют для выделения чистой культуры анаэробов? 6 Поясните порядок работы с микробными культурами. 7 Как проводят посев микроорганизмов в жидкие, плотные, полужидкие питательные среды? 8 Какое оборудование необходимо для культивирования микроорганизмов в лабораторных условиях? 9 Как выращивают анаэробные микроорганизмы?

Тема 7 «Методы изучения культуральных и биохимических свойств бактерий»

Цель – формирование знаний о культуральных и биохимических свойствах бактерий, умений определения культуральных особенностей бактерий, их типизации по биохимическим свойствам, делать заключение по изученному материалу, навыков работы с источниками информации и лабораторным оборудованием.

План

1. Изучить методические указания к занятиям № 7.

2. Изучить биологические свойства музейных микробных культур, провести учет биохимических свойств микробных культур, определить вид микробной культуры и отчитаться преподавателю о проделанной работе.

Материальное обеспечение: микробные культуры обучающихся с предыдущего занятия на МПА и МПБ, стерильные пастеровские пипетки, спирт, пробирки с жидкими средами Гисса — с индикатором Андредэ, с углеводами и поплавками, молоко с метиленовым синим и молоко с лакмусом, МПБ, МПЖ по одной пробирке, чашки Петри с агаром Эндо (или Левина) и кровяным агаром, индикаторные бумажки для определения сероводорода, индола.

Теоретический материал

Изучение культуральных свойств бактерий.

Культуральные свойства бактерий – это характер роста микроорганизма в питательной среде.

Рост бактерий на плотных питательных средах (МПА) проявляется образованием колоний двух основных форм S (гладкая) и R (шероховатая). Колония – это скопление микробов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки. Колонии характеризуются большим разнообразием, могут быть изолированными и слившимися. Изучение их проводят невооруженным глазом и с помощью микроскопа (объектив х8) или лупы. При изучении культуральных свойств бактерий на плотной среде определяют следующие характеристики колоний (рост на МПА):

· характер роста (определить - обильный, умеренный, скудный);

· однотипность (указать, сколько различных типов колоний обнаружено в пробирке, чашке Петри);

· форма (определить S или R форма);

· размер (измерить диаметр колонии в мм; до 1 мм – росинчатые; 1-2 мм – мелкие; 2-4 мм – средние; более 4 мм – крупные колонии);

· край (S-форма - ровный; R-форма – шероховатый, волнистый, бахромчатый, зубчатый, локонообразный, изрезанный);

· профиль (рельеф) (просматривают в отраженном свете — выпуклый, плоский, конусовидный, кратерообразный, с валиком по окружности);

· поверхность (гладкая, бугристая, мучнистая, морщинистая, складчатая, с концентрическими кругами и др.);

· прозрачность (просматривать в проходящем свете - прозрачная, непрозрачная, мутная, тусклая, блестящая, флуоресцирующая колония);

· консистенция (определяют прикосновением к поверхности колонии бактериологической петлей) — плотная (легко снимается с агара или врастает в толщу среды), крошковатая, хрупкая, слизистая (тягучая, прилипает к петле), тестообразная, маслянистая;

· цвет (серовато-белая, бесцветная, белая, кремовая, оранжевая, голубоватая, зеленая, золотистая, желтая, красная, синяя, черная и др. Цвет колоний культуры бактерий зависит от цвета вырабатываемого ими пигмента.);

· запах (определяют при открывании пробирки, чашки Петри, осторожно, не допуская заражения исследователя аэрогенным путем).

Рост микроорганизмов в жидких питательных средах (МПБ) определяют визуально и отмечают следующие показатели (рост в МПБ):

· характер и степень помутнения среды - равномерное (диффузное), интенсивное, умеренное, слабое и в виде опалесценции;

· наличие пленки и её характер - на всей поверхности среды, подниматься (загибаться) на стенки пробирки или колбы или покрывать только часть поверхности среды, не доходя до стенки сосуда. Учитывают цвет, оттенок пленки (голубоватый, желтоватый, серый, белый), толщину (тонкая, толстая, нежная, грубая), характер поверхности пленки (складчатая, морщинистая, гладкая, сетчатая, пушистая), консистенцию (хрупкая, слизистая, сальная)

· осадок и его характер - он может быть обильный и незначительный, плотный (компактный), рыхлый, зернистый, в виде комочков ваты, хлопьевидный, крошковидный, слизистый. По цвету — белый, желтоватый, матовый, зеленоватый, сероватый и др. При встряхивании осадок либо разбивается, создавая равномерное помутнение среды, либо образуются крупные или мелкие хлопья, глыбки; слизистый осадок может подниматься вверх в виде «косички», вызывая помутнение среды, или среда при этом остается прозрачной

· наличие пристеночного кольца – определить наличие пристеночного роста бактерий, полная или частичная выраженность «кольца»;

· цвет среды (пигмент) – определить изменение цвета среды;

· запах – определить аналогично изучению свойств на плотной среде.

Рост микробов в полужидкой среде (МППА), не обладающих подвижностью, происходит по уколу в виде беловатого стержня. Окружающая среда при этом остается прозрачной. Подвижные микроорганизмы вызывают помутнение полужидкого агара разной интенсивности, распространяющееся в виде «облачков». Посев микробов в МППА, МПА (столбиком), МПЖ делают уколом строго по центру вглубь среды или в непосредственной близости к стенке пробирки.

Изучение биохимических (ферментативных) свойств бактерий.

Биохимическая активность микроорганизмов обусловлена наличием у них специфических ферментов, а также условиями окружающей среды. Ферменты играют большую роль в жизнедеятельности микробов — они участвуют в различных биохимических реакциях, лежащих в основе питания, дыхания, роста и размножения микроорганизмов.

Микробы разных видов при оптимальных условиях продуцируют постоянные ферменты или группу ферментов; отдельные виды микроорганизмов обладают способностью расщеплять только белки и углеводы с образованием конечных и побочных продуктов распада, а некоторые — окислять и восстанавливать различные субстраты.

В лабораторной микробиологической практике изучение биохимических свойств бактерий является одним из важнейших дифференциально-диагностических методов точного распознавания возбудителя инфекционной болезни (идентификации возбудителя). Обычно определяют сахаролитические, протеолитические и редуцирующие свойства бактерий.

Сахаролитические свойства – это способность микроорганизма расщеплять углеводы. Сахаролитические свойства определяют при посеве бактерий на дифференциально-диагностические среды с разными углеводами и индикатором. Чаще применяют среды Гисса с индикатором Андредэ. Набор сред с разными углеводами (глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза, маннит, дульцит, арабиноза, сорбит и др.), стерильное обезжиренное простое молоко, молоко с лакмусом, молоко с метиленовым синим — называют пестрым рядом. Посевы культур осуществляют по общепринятой методике бактериологической петлей или пастеровской пипеткой. После инкубирования в термостате учитывают результат ферментации углеводов: изменение цвета питательной среды (в красный цвет при индикаторе Андредэ) означает расщепление углевода и образование кислоты. При расщеплении отдельных углеводов образуется не только кислота, но и газообразные вещества, которые вытесняют часть жидкости из поплавка, и пузырьки жидкости скапливаются в его верхней части. Для определения сахаролитических свойств часто применяют полужидкие среды с углеводами и индикатором ВР (смесь водного голубого с розоловой кислотой), а также плотные среды с углеводами и индикатором (например, агар Эндо, агар Левина, Плоскирева).

Протеолитические свойства – это способность микроорганизмов расщеплять белки. Протеолитические свойства определяют прямым или косвенным методами.

Прямой метод заключается в посеве исследуемой чистой культуры микроорганизма в белоксодержащие среды (МПЖ, свёрнутая сыворотка крови, молоко) и определении изменений в средах после культивирования в термостате (разжижение МПЖ, сыворотки крови, свертывание (коагуляция) молока). Микробы различных видов разжижают желатину (МПЖ) неодинаково. Одни из них — в виде воронки (возбудитель сибирской язвы), другие — в виде «чулка» (стафилококки). Бывает разжижение послойное (синегнойная палочка — Pseudomonas aeruginosa и др.)

Косвенный метод заключается в обнаружении газов, образующихся при гниении белков (сероводорода, индола, аммиака и др.).

Определение индола

Индол устанавливают различными методами. Наиболее доступным и удобным считается метод с использованием индикаторных бумажек, приготовленных по одному из нижеприведенных рецептов.

1. Фильтровальную бумагу пропитывают горячим насыщенным водным 12 % - ным раствором щавелевой кислоты, высушивают на воздухе, разрезают на полоски (10 X 0,5 см) и хранят в стеклянной банке с притертой пробкой. Чтобы выявить образование индола, исследуемую культуру бактерий засевают в пробирку с МПБ или бульоном Хоттингера, куда вставляют индикаторную бумажку, прижимая ее конец ватной пробкой (нижний край бумажки не должен касаться питательной среды). Выдерживают в термостате при 37 °С 1—3 дня. При наличии индолообразования нижняя часть индикаторной бумажки окрашивается в розовый цвет (просматривать при проходящем свете).

2. Фильтровальную бумажку пропитывают теплой смесью, составляющей реактив Эрлиха (парадиметиламидобензальдегида – 3-5 г, 96 %-ного спирта-ректификата —50 мл, очищенной концентрированной соляной кислоты - 10мл). Бумагу высушивают на воздухе и разрезают на полоски. Цвет готовых бумажек желтый. Хранят их в стеклянной банке с притертой пробкой. При наличии индола нижний конец, бумажки (прикрепленный, как и в предыдущем способе) окрашивается от темно-розового до интенсивно-малинового цвета (другой цвет не учитывается).

Определение сероводорода проводят в жидкой среде. Метод основан на почернении полоски фильтровальной бумажки, пропитанной 10 %-ным раствором уксуснокислого свинца (образуется сернистый свинец черного цвета).

Определение аммиака ( NH₃).

1. В пробирке с засеянной бактериальной культурой закрепляют между стенкой пробирки и пробкой розовую лакмусовую бумажку, которая в присутствии аммиака синеет.

2. В фарфоровую чашку пипеткой вносят каплю бульонной культуры микробов и смешивают с каплей реактива Несслера. При наличии аммиака (в зависимости от его количества) культура с индикатором приобретает желтое или коричневое окрашивание. Реактив Несслера представляет собой смесь двух растворов: а) йодистого калия с химически чистой сулемой и б) 50 %-ного раствора КОН.

Редуцирующие свойства – это способность бактерий разлагать или восстанавливать анилиновые краски. Редуцирующие свойства определяют на основании изменения цвета краски (метиленовой сини, малахитовой зелени, нейтрального красного и др.), внесенной в питательную среду (часто в молоко). Петлю исследуемой культуры высевают в питательную среду с краской, инкубируют в термостате 24 ч. Под действием микробных ферментов краситель восстанавливается, происходит его обесцвечивание или изменение первоначального цвета.

Определение редуцирующих свойств на среде Минкевича (молоко с лакмусовой настойкой). Посевы инкубируют в термостате 10 дней, ежедневно просматривая пробирки. Редукция лакмуса проявляется полным обесцвечиванием молока. На этой же среде выявляют кислото- и щелочеобразование. В первом случае лакмусовое молоко интенсивно розовеет, во втором — синеет.

Редукцию нитратов (денитрификацию), то есть восстановление соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты), а затем в аммиак и свободный азот, определяют посевом на специальную среду (МПБ с добавлением 2 %-ного азотнокислого калия, свободного от нитритов) исследуемой бактериальной культуры и через 48— 72 ч культивирования в термостате при 37—38 °С добавляют 1 мл реактива, содержащего в определенных пропорциях йодистый калий и 10 %-ную H₂SO₄. При редукции нитратов в нитриты среда окрашивается в темно-синий цвет.

Определение каталазы можно осуществлять разными способами.

1. На поверхность суточной агаровой культуры равномерно тонким слоем наносят 1 мл 1 %-ного раствора перекиси водорода. При наличии каталазы отмечают выделение пузырьков отщепленного кислорода.

2. На предметное стекло наносят каплю 3—10 % - ного раствора перекиси водорода и вносят в нее петлю бактериальной агаровой культуры. Выделение пузырьков газа (кислорода) свидетельствует о наличии у микробов каталазы.

3. Определение каталазы в бульонной культуре — в пробирку вносят 1 мл культуры и добавляют к ней 1 мл 10 % - ного раствора перекиси водорода. Выделение пузырьков газа (разной интенсивности) указывает на каталазную активность бактериальной культуры.

Определение гемолитических свойств. Бактерии некоторых видов в процессе жизнедеятельности продуцируют особые вещества, обладающие лизирующим действием на эритроциты,— гемотоксины (белковой природы), разрушающие оболочку эритроцитов. Для определения гемолитической способности бактериальные культуры высевают на питательные среды, содержащие 5 % дефибринированной крови (чаще кровяной МПА). При росте микроорганизмов, обладающих гемолитическими свойствами, вокруг колонии в результате лизису эритроцитов образуется прозрачная зона (бесцветная или окрашенная). В жидких средах при гемолизе среда становится прозрачной (красная лаковая кровь).

Практическое задание 1: Изучить теоретический материал теме занятия.

Этапы выполнения задания:

1 Изучить понятия культуральные и биохимические свойства бактерий.

2 Усвоить методы определения культуральных свойств микроорганизмов в жидких, плотных и полужидких средах.

3 Усвоить методы определения биохимических свойств бактерий.

4 Законспектировать теоретический материал по теме занятия.

Практическое задание 2: Определить культуральные свойства микроорганизмов в питательных средах.

Этапы выполнения задания:

1 Провести учет роста микробных культур в МПБ, МПА скос, МПА в чашке Петри.

2 Результаты исследований записать в тетрадь и отчитаться преподавателю.

Практическое задание 3: Изучить биохимические свойства микроорганизмов в питательных средах Гисса.

Этапы выполнения задания:

1 Учесть результаты роста музейных культур в средах Гисса, определить биохимические свойства и типировать микробные культуры.

2 Результаты исследований записать в тетрадь, сделать заключение и отчитаться преподавателю.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Что означают биохимические свойства микроорганизмов? 2 Какую роль играют ферменты в микробной клетке? 3 Как определить сахаролитическую активность бактерий? 4 Что такое протеолитические свойства и какими методами их определяют? 5 Как проводят идентификацию выделенных штаммов микроорганизмов? 6 Что означает термин «редукция»? 7 Какими методами определяют образование микроорганизмами индола, сероводорода, аммиака. 8 Как определяют редуцирующие свойства микробов? 9 С какой целью определяют гемолитические свойства бактерий, чем они обусловлены? 10 Что такое культуральные свойства микробов? 11 Чем проявляется рост микроорганизмов на плотных питательных средах? 12 Поясните особенности роста бактерий в жидких и полужидких средах. 13 На чем основан принцип идентификации микробов? 14 Колонии каких основных типов образуют бактерии в плотных питательных средах?

План

1. Изучить методические указания к занятию № 8.

2. Определить чувствительность микробных культур к антибиотикам методом диффузии в агар, отчитаться преподавателю о проделанной работе.

Материальное обеспечение: музейные микробные культуры в пробирках, стерильные среды (МПА, солевой агар) в чашках Петри, стандартные диски с антибиотиками, пробирки со стерильным физ. раствором, спиртовки, инструменты для проведения посева микробных культур.

Теоретический материал

Антибиотики — специфические продукты жизнедеятельности бактерий (в том числе актиномицетов), грибов, растений (фитонциды) и животных, обладающие активностью по отношению к микроорганизмам определенных групп.

Бактериостатическое действие антибиотика – это его способность задерживать рост определенного микроорганизма.

Бактерицидное действие антибиотика – это его способность полностью подавлять жизнедеятельность определенного микроорганизма.

Антибиотики готовят промышленным путем в виде солей натрия, калия, кальция и выпускают в специальных упаковках. При выпуске антибиотика (промышленном или лабораторном) обязателен контроль его активности.

Биологическую активность антибиотиков выражают в единицах действия (ЕД), содержащихся в 1 мл раствора (ЕД/мл) или в 1 мг препарата (ЕД/мг). За одну единицу принимают минимальное количество антибиотика, которое подавляет рост стандартного тест-микроба в строго определенном объеме питательной среды. При установлении активности каждого антибиотика используют определенный для того или иного препарата тест-микроб, обладающий самой высокой чувствительностью к данному антибиотику.

Для определения активности антибиотика чаще используют биологический метод, в основе которого лежит выявление интенсивности воздействия препарата на живую микробную клетку.

В ветеринарной практике антибиотики с учетом спектра их действия используют с лечебной целью при некоторых инфекционных болезнях животных. Вначале устанавливают возбудителя болезни проведением бактериологического исследования, а затем проверяют чувствительность (или резистентность) выделенного вида микроба к антибиотикам. Чувствительность микроба (возбудителя болезни) к антибиотикам выражается задержкой его роста или гибелью от минимальной концентрации препарата (мкг, ЕД/мл) в течение 16—18 ч.

Чувствительность микроба к антибиотикам проверяют методами:

1) серийных разведений в жидкой или на плотной питательной среде;

2) диффузии в агар с применением дисков, содержащих антибиотики.

Метод серийных разведений включает следующие основные этапы:

· выбор питательных сред,

приготовление растворов антибиотиков,
подготовка микробных культур для исследования
учет результатов.

Питательная среда должна обеспечивать оптимальный рост культуры микроба (возбудителя болезни).

В жидкой среде при определении чувствительности одного штамма микроба к одному антибиотику необходимо иметь шесть пробирок с 2 мл среды в каждой (для серийного разведения антибиотика), две пробирки по 9—10 мл среды для разведения культуры микроба и колбу с питательной средой для приготовления рабочего раствора антибиотика. Сначала готовят его основной раствор (используя также стандарты антибиотиков определенной активности) из расчета 1000 мкг антибиотика в 1 мл растворителя (дистиллированной воды, буферного раствора). Рабочие растворы готовят на питательной среде из основного раствора методом последовательных двукратных разведений, чтобы в 1 мл среды концентрация антибиотика была соответственно, начиная с первой пробирки,—0,25; 0,12; 0,06; 0,03; 0,015; 0,007 мкг.

При использовании плотной среды рабочие разведения антибиотиков готовят в шести пробирках так, чтобы количество препарата в первой пробирке было 400, во второй — 200, в третьей — 100, в четвертой — 50, в пятой — 25 и в шестой — 12,5 мкг/мл. Из каждой пробирки по 1 мл разведенного антибиотика стерильной пипеткой переносят в чашку Петри и добавляют в нее 19 мл расплавленного (и охлажденного до 55 °С) МПА, вращательными движениями смешивают и оставляют на столе до затвердения среды. Концентрация препарата в чашках Петри становится в 20 раз ниже, чем в пробирках (соответственно 20; 10; 5; 2,5; 1,25 и 0,6 мкг/мл).

В ряды пробирок или чашек Петри с питательной средой, содержащие разведенный антибиотик, засевают чистую 16-18-часовую бульонную культуру микроба, выделенную из исследуемого материала, разведенную до концентрации 500 млн микробных тел в 1 мл в соответствии со стандартом мутности. После 16—18-часового инкубирования посевов в термостате при 37 °С учитывают результат. Отмечают пробирку (или чашку), в которой отсутствует рост. Количество антибиотика в ней и последующей пробирке (чашке), где наблюдается рост бактерий, складывают, выводят среднее арифметическое, которое показывает чувствительность микроорганизма к данному антибиотику. Наличие роста бактерий свидетельствует об их резистентности к данному препарату, а отсутствие роста является показателем высокой чувствительности бактерий к антибиотику.

Метод диффузии в агар с применением стандартных дисков, содержащих антибиотики.

На поверхность плотной питательной среды наливают 1 мл одномиллиардной взвеси (в 0,9 %-ном растворе NaCl) агаровой культуры микроба. Культуру равномерно распределяют по питательной среде шпателем из пастеровской пипетки (газонный посев). Чашки при необходимости подсушивают в термостате 15 мин (37 °С), или при комнатной температуре 30—40 мин. Затем на поверхность засеянной среды стерильным пинцетом накладывают (прижимают) стандартные бумажные диски с разными антибиотиками на расстоянии 2 см от края и друг от друга, один диск — в центре чашки. После наложения каждого диска пинцет следует обжигать на пламени горелки. Сначала чашки выдерживают при комнатной температуре (2 ч), затем, перевернув их вверх дном, помещают в термостат на 16—18 ч при 37 °С. Оценку результатов проводят с учетом наличия или отсутствия зоны задержки роста, размера зоны вокруг диска с антибиотиком. Отсутствие зоны задержки роста бактерий свидетельствует о нечувствительности их к данному препарату. Если проявляется зона задержки роста, ее измеряют по диаметру (включая диаметр диска) с помощью линейки.

Оценка результатов:

· зона задержки до 15 мм является показателем малой чувствительности,

· зона в 15—25 мм указывает на достаточную чувствительность испытуемой бактериальной культуры.

Чем больше зона задержки роста бактерий, тем выше их чувствительность к данному препарату.

Стандартные диски с антибиотиками выпускают предприятия медицинской промышленности, Диски хранят в закрытых флаконах в сухом месте при комнатной температуре.

Фаги — вирусы определенной формы и структуры. Бактериофаги (фаги) характеризуются своим литическим действием на гомологичные им виды бактерий. Это явление называется бактериофагией (греч. phagein — пожирать). О присутствии фага судят по его специфическому действию на соответствующий вид бактерий. Название фага происходит от названия вида микроба, лизируемого данным фагом (коли-фаг, суипестифер-фаг, сибиреязвенный гамма-фаг и др.). Хотя фаги отличаются специфичностью по отношению к гомологичному виду микроба, но действуют также и на группу родственных видов бактерий. Фаги обладают антигенными свойствами, их используют для гипериммунизации животных с целью получения антифаговых диагностических сывороток. Лизирующее действие фага внешне выражается полным просветлением бульонных культур и образованием прозрачных участков среди сплошного роста бактерий на засеянной поверхности плотной среды (стерильные пятна).

Методика обнаружения фага.

1 В две пробирки с жидкой средой засевают гомологичную фагу бактериальную культуру. В одну из пробирок пастеровской пипеткой вносят, каплю фага. Обе пробирки помещают в термостат. Через 16—18 ч в пробирке, где находился фаг, вследствие лизиса бактерий под его влиянием бульон просветляется. В другой пробирке (без фага) наблюдается обильный рост засеянной культуры.

2 Обе засеянные пробирки ставят в термостат, через 4-6 ч роста культуры при четко выраженном помутнении среды в одну из пробирок вносят каплю специфического фага и обе пробирки вновь ставят в термостат и учитывают результат через 16—18 ч (после первоначального посева). В пробирке с фагом среда просветляется, а без фага — она становится еще более мутной (обильный рост культуры).

3 Для выявления действия фага на плотной среде бульонную культуру высевают на агар в чашках Петри: 1 каплю культуры растирают стеклянным шпателем по всей поверхности агара, крышку закрывают, чашки помещают в термостат на 3—4 ч. Затем в одну чашку на агаре с молодой культурой вносят фаг по одной капле в нескольких местах и вновь чашки ставят в термостат на сутки. По истечении этого времени в контрольной чашке (без фага) обычно наблюдается обильный сплошной рост бактерий по всей поверхности среды; в чашке с добавленным фагом наблюдается задержка роста бактерий в местах нахождения капель с фагом.

Для практических целей фаги серийно производят на биофабриках. Каждая серия фага перед ее выпуском проверяется на активность, то есть проверяют титр фага — это наименьшая концентрация (или наибольшая степень разведения), которая способна лизировать гомологичную культуру. Чем выше степень разведения, тем активнее фаг.

Бактериофаги используют:

1) для фагодиагностики возбудителей сибирской язвы, сальмонеллеза и некоторых других (путем обнаружения специфического фага в исследуемом материале и воздействием специфического фага на бактериальную культуру, выделенную из исследуемого материала);

2) для лечения и профилактики инфекционных болезней (сальмонеллез, колибактериоз);

3) для идентификации микробов в объектах внешней среды (сточные воды и др.)

4) методика реакции нарастания титра фага рекомендуется для санитарной оценки воды, молока, почвы и других материалов.

Практическое задание 1: Изучить теоретический материал теме занятия.

Этапы выполнения задания:

1 Изучить понятие и классификацию антибиотиков, бактериофагов.

2 Усвоить методы определения активности антибиотиков, чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

3 Усвоить понятие бактериофаги и методы применения бактериофагов в ветеринарии.

4 Законспектировать теоретический материал по теме занятия.

Практическое задание 2: Определить антибиотикочувствительность микробных культур методом диффузии в агар.

Этапы выполнения задания:

1 Засеять микробную культуру на МПА в чашках Петри.

2 Разместить стандартные диски с четырьмя или пятью антибиотиками на поверхность агара, засеянного культурой бактерий. Поместить чашки в термостат для культивирования.

3 На следующем занятии определить зону задержки роста микробов вокруг диска с антибиотиком, сделать заключение и отчитаться преподавателю.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Что такое антибиотики? 2 Поясните классификация антибиотиков по происхождению, механизму и спектру действия? 3 Назовите единицы измерения активности антибиотиков. 4Какими методами определяют активность антибиотиков? 5 Какими методами определяют чувствительность микробов к разным антибиотикам. 6 К какой группе микроорганизмов относится бактериофаг? 7 С какой целью исполь зуют явление бактериофагии? 8 Что такое колония фага, стерильные пятна фага? 9 Какими свойствами обладают бактериофаги?

Рекомендуемая литература и источники

1. Госманов, Р. Г. Практикум по ветеринарной микробиологии и микологии [Электронный ресурс] : учеб. пособие / Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев, А. А. Барсков. – Санкт-Петербург : Лань, 2014. — 397 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=45680

2. Госманов Р. Г. Микробиология [Электронный ресурс] : учебное пособие / Госманов Р. Г., Галиуллин А. К., Волков А. Х. [и др.]. — Электрон. дан. — СПб. : Лань, 2011. — 495 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=1546

3. Госманов Р. Г. Микробиология и иммунология [Электронный ресурс] : учебное пособие / Госманов Р. Г., Ибрагимова А. И., А.К. Галиуллин. — Электрон. дан. — СПб. : Лань, 2013. — 240 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=12976

4. Кисленко В. Н. Ветеринарная микробиология и иммунология. Практикум + CD [Электронный ресурс] : учебное пособие. — Электрон. дан. — СПб. : Лань, 2012. — 368 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=3815

5. Колычев, Н. М. Ветеринарная микробиология и микология [Электронный ресурс] : учебник / Н. М. Колычев, Р. Г. Госманов. – Санкт-Петербург : Лань, 2014. — 632 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=39147.

ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И МИКОЛОГИЯ

12 3 4 5 6 7 Следующая ⇒

Последнее изменение этой страницы: 2019-03-22; Просмотров: 612; Нарушение авторского права страницы