Тема 5 «Стерилизация. Питательные среды»

Цель – формирование знаний о видах питательных сред, умения приготовления питательных сред, их стерилизации и применения для культивирования микроорганизмов, делать заключение по изученному материалу, навыков работы с источниками информации.

План

1. Изучить методические указания к занятию № 5.

2. Изучить классификацию питательных сред, требования, предъявляемые к питательным средам, понятие и методы стерилизации, применяемые в лаборатории, отчитаться преподавателю о проделанной работе.

Материальное обеспечение: набор сухих питательных сред (любых) в заводской упаковке – 6-7 единиц, готовые питательные среды в пробирках и чашках Петри (МПА, МПБ, агар Сабуро, солевой агар, Китта-Тароцци, Кесслер, Левенштейна-Йенсена и др.), в чашках Петри: пептон, ΝaCl, агар – агар, чистая сухая колба на 250 мл с ватно-марлевой пробкой – 2 штуки, дистиллированная вода – 300 мл, мерная колба или цилиндр на 100 мл, весы электрические, фильтровальная бумага, чистая стеклянная лабораторная посуда (пробирки, пипетки, колбы, цилиндры), стерилизатор с инструментами, стерильные пастеровские пипетки, бикс, маркер, газетная бумага для завертывания посуды, фильтры (асбестовые – разного диаметра, керамические - Шамберлана, мембранные), вату, нитки, марлю, бинт.

Теоретический материал

Питательные среды применяют для получения чистых культур микроорганизмов, изучения их морфологических и физиологических свойств, накопления больших количеств микробов в лабораторных условиях.

Классификация питательных сред:

по происхождению: естественные (натуральные) и искусственные (синтетические).

Естественные среды состоят из продуктов животного и растительного происхождения, имеют сложный и непостоянный состав. Искусственные среды имеют в составе определенные химические органические и неорганические соединения в точно указанных концентрациях.

по составу: белковые, безбелковые, минеральные.

по консистенции: жидкие (МПБ), полужидкие (МПЖ, ПЖА), плотные (МПА).

Для придания плотности в питательные среды добавляют агар-агар (высушенные морские водоросли).

по назначению: обычные, специальные, элективные, дифференциально-диагностические.

Обычные среды применяют для выращивания большинства микроорганизмов, к ним относятся МПА, МПБ, МПЖ.

Специальные среды применяют для выделения и культивирования определенных групп или видов микробов. Например, солевой агар – для стафилококков; агар Сабуро, Чапека, сусло-агар – для микроскопических грибов; среда Омелянского – для выделения возбудителей анаэробного разложения клетчатки.

Элективные (избирательные) среды пригодны для развития одного вида микробов или группы родственных микроорганизмов. Например, среда Кесслер – для выделения бактерий группы кишечной палочки (БГКП), среда Левенштейна-Йенсена – для выделения возбудителей туберкулеза, среда Любашенко, Терских – для выделения лептоспир.

Дифференциально-диагностические среды применяют для изучения биохимических свойств микробов и выделения чистых культур некоторых микробов. Например, среды Гисса с углеводами, плотные среды с индикаторами – Эндо, Левина, Плоскирева и др.

Требования, предъявляемые к питательным средам:

• содержать необходимые для микробов питательные вещества: источники азота, углерода, кислорода и водорода, неорганические вещества, факторы роста;
• быть влажной, т.к. микробы усваивают только растворенные питательные вещества;
• быть стерильной, не содержать никаких микроорганизмов;
• быть прозрачной, чтобы можно было изучать культуральные свойства микробов;
• иметь определенную рН среды (7,0-7,4 - для большинства бактерий; 6,8 – для микроскопических грибов и т.д.).

Контроль стерильности питательных сред. Подготовленные для посева среды в пробирках, чашках Петри помещают в термостат на 24 часа при 37ºС. При отсутствии признаков роста, среду признают стерильной, и используют для посева.

Контроль ростовых качеств питательных сред. Из подготовленной партии питательной среды берут 2-3 пробирки, (чашки Петри), высевают на них соответствующие музейные культуры и выдерживают в термостате необходимое для роста данного микроорганизма время. При обнаружении характерного роста среду признают пригодной к использованию.

Хранение питательных сред. Питательные среды хранят в холодильнике при температуре +4 +6 ºС или в шкафу при комнатной температуре, не допуская высушивания среды. Для работы лучше использовать свежеприготовленные среды, поэтому длительное хранение сред не допускается.

Приготовление питательных сред в настоящее время не представляет особых трудностей в связи с тем, что промышленность выпускает сухие полуфабрикаты питательных сред, сбалансированные по всем необходимым для культивирования микроорганизмов веществам. Однако можно приготовить питательные среды и из отдельных компонентов.

Мясо - пептонный бульон (МПБ). В начале готовят мясную воду. Для этого берут 500 г нежирной говядины без костей и сухожилий. Пропускают через мясорубку. Заливают 1 литром воды и настаивают сутки в холодильнике. Затем фарш отжимают через марлю и кипятят на слабом огне в течение часа. Фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам. Стерилизуют 30минут при температуре 120 градусов в автоклаве. Хранят в холодильнике.

К 1 л мясной воды прибавляют 1% пептона, 0,5% поваренной соли и кипятят 10 мин. Определяют рН (доводят её до 7,6-7,7) фильтруют, разливают по пробиркам, автоклавируют.

Мясо - пептонный агар (МПА - плотная питательная среда). К МПБ добавляют 2 проц. агар-агара и кипятят до его расплавления, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробиркам и автоклавируют. Скашивают его горячим под углом 5-6°.

Мясо-пептонный полужидкий агар (МПЖА) готовят также, как и МПА, но агар-агара добавляют от 0,15 до 0,25%.

Определение рН питательных сред. Производится с помощью рН -метра или компаратора Михаэлиса. В компараторе имеется набор цветных стандартных растворов из мета и паранитрофенола, интенсивность окраски которых соответствует реакции жидкости в пробирке от 5,4 до 8,6 (интервалы 0,2).

Определение рН производится в специальном штативе, в гнезда которого вставляют пробирки в следующем порядке:

№ I и 3 - пробирки с 2 мл бульона и добавляют 5 мл дистиллированной воды;

№ 2 - 2 мл бульона, 4 мл дистиллированной воды и 1 мл индикатора;

№ 4 - стандарты;

№ 5- 5-7мл дистилированной воды

Пробирки рассматривают на свет через нижнее боковое отверстие, сравнивают цвет испытуемого бульона (пробирка № 2) со стандартами. Если цвет не совпадает с нужным стандартом, то в эту пробирку добавляют из градуированной пипетки раствор щелочи, пока цвет ее не сравняется со стандартной. Количество добавленной щелочи на 2 мл бульона пересчитывают на весь объем приготовленной среды, отмеряют и добавляют к ней раствор щелочи. При исследовании мутных жидкостей в компаратор вставляют матовый светофильтр, а окрашенных в желтый цвет - синий светофильтр.

Стерилизация (лат. sterilis — бесплодие, обеспложивание) — процесс, вызывающий гибель патогенных и непатогенных микроорганизмов и их форм (вегетативных и споровых) в каком-либо материале. В бактериологических лабораториях стерилизуют питательные среды, стеклянную посуду (пипетки, пробирки, чашки Петри и др.), инструменты, ватные и марлевые тампоны и др. Для специальных условий асептической работы стерилизуют воздух и необходимые предметы в боксах. Для стерилизации используют физические и химические методы.

ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ включают:

 1) стерилизацию сухим жаром (фламбирование, сухим нагретым воздухом),

 2) стерилизацию влажным жаром (кипячение, текучим паром при 100 °С, дробная стерилизация при температуре ниже 100 °С, стерилизация паром под давлением с темпе­ратурой выше 100 °С, пастеризация),

 3) стерилизацию фильтрованием (бактериологические фильтры),

 4) ультрафиолетовыми лучами,

 5) ультразвуком.

Методы стерилизации сухим жаром.

Фламбированием, или прокаливанием, стерилизуют обычно бактерио­логические петли, пинцеты и другие металлические пред­меты.

Стерилизация сухим нагретым воздухом осуществляется в специальных сушильных шкафах с двойными стенками. Снаружи шкаф облицован теплонепроницаемым материалом, внутри - стенки метал­лические. В верхней части шкафа находится термометр. Между теплонепроницаемой обшивкой и внутренним ме­таллическим шкафом на дне имеется автоматический элект­ронагревательный элемент. В сушильном шкафу стерилизуют чистую стеклянную посуду. Колбы закрывают ватными пробками, накрывают бумажными колпачками и завязывают. Чашки Петри и пастеровские пипетки завертывают пачками в пергаментную бумагу. Режим стерилизации — при температуре 155—160 °С, экспозиция 2 ч, при 165— 170 °С — 1—1,5 ч, при 180 °С — 1ч. По истечении времени стерилизации нагревание прекращают и, лишь когда температура снизится примерно до 45 °С, шкаф открывают. Воспламеняющиеся вещества, питательные среды, резиновые предметы стерилизовать сухим жаром нельзя.

Методы стерилизации влажным жаром.

Кипяче­ние — общепринятый метод стерилизации инструментов (шприцы, иглы, пинцеты, ножницы, скальпели и др.) и некоторых резиновых и стеклянных предметов, которые раскладывают в специальных закрывающихся металлических ванночках — стерилизаторах, имеющих вставную решетку — подставку. Эту подставку выстилают 2—3 слоями марли или тонким слоем гигроскопической ваты. Шприцы стерилизуют в разобранном виде, в иглы вставляют мандрены. Режущие инструменты — лезвия скальпелей, ножниц — рекомендуется обертывать марлей или ватой. В стерилизатор наливают воду (лучше дистиллирован­ную) так, чтобы она полностью покрывала инструменты, и добавляют 2 %-ный гидрокарбонат Na. Стерилизатор закрывают крышкой. Кипятят 20—30 мин. После стерилизации воду осторожно сливают, а инструменты используют только после их охлаждения.

Стерилизация текучим паром — в основу этого метода положен способ дробной стерилизации (разработанный Тиндалем, 1877) при разных температурных режимах не выше 100 °С. Осуществляют стерилизацию в текучепаровом аппарате Коха при 100 °С 30—40 минут. Аппарат Коха представляет собой одностенный металлический котел цилиндрической формы с двойным дном, закрывающийся крышкой с отверстием для термометра и выхода пара. Внутри котла имеются специальная подставка с отверстиями для стерилизуемого материала и нагревательные элементы. На дно аппарата наливают воду. Началом стерилизации считают момент закипания воды. Образуемый пар устремляется вверх непрерывной струей, соприкасаясь с обрабатываемым материалом. Стерилизацию проводят 3 дня подряд. Однократное прогревание убивает только вегетативные формы микроорганизмов. Оставшиеся жизнеспособными споры бацилл в периоды между стерилизацией прорастают в вегетативные формы. Стерилизация на следующий день вызывает их гибель. На третий день прогревание гарантирует полное обеспложивание материала. Текучим паром стерилизуют питательные среды (и другие материалы), которые разрушаются при нагревании их выше 100 °С (желатина, углеводы).

Тиндализация — дробная стерилизация при температурах ниже 100ºС. Стерилизацию осуществляют в водяной бане. Принцип этого метода тот же, что и при сте­рилизации текучим паром. Кратность прогрева зависит от применяемых температур: при 70—80 °С в течение 3 дней, 60—65 °С — 5 дней, 56—58 °С — в течение 6—7 дней. В первый день материалы стерилизуют 2 ч, в последующие дни — по одному часу. В промежутках между прогреваниями стерилизуемый материал выдерживают при комнатной температуре для прорастания спор. Тиндализации при 56—58 °С подвергают материалы, разрушающиеся при более высокой температуре (коллоидные растворы, сыворотка крови и др.), белок содержащие вещества.

Автоклавирование — стерилизация паром под давлением с высокой температурой, осуществляют в специальном аппарате — автоклаве. В основе этого метода лежит нагревание помещенного в автоклав материала, герметически закрытого крышкой, чистым насыщенным паром под давлением выше атмосферного. При встрече насыщенного пара с более холодным объектом пар конденсируется, превращаясь в воду, в результате чего выделяется большое количество тепла и температура стерилизуемого объекта быстро повышается. Кроме того, при конденсации пара происходит уменьшение его объема, что способствует проникновению пара во внутренние части стерилизуемого материала. Современные автоклавы электрические; промышленность выпускает автоклавы вертикальные и горизонтальные.

Манометр показывает давление пара без учета окружающего атмосферного давления (760 мм рт. ст.). По истечении времени стерилизации автоклав отключают. После остывания при нулевом показании манометра откры­вают кран для спуска пара. Крышку открывают осторожно на себя, не заглядывая в котел, оберегая лицо, глаза от возможного остаточного пара. До полного выхода пара открывать крышку нельзя, так как при быстром падении давления внутри автоклава стерилизуемые жидкие среды закипают, пробки из пробирок выталкиваются вместе с жидкостью.

В автоклаве стерилизуют питательные среды, выдержи­вающие нагревание выше 100 °С (МПА, МПБ, физ.раствор), стеклянную посуду, завернутую в бумагу, перевязочный материал, халаты, заложенные в металлические биксы. Кроме того, в автоклаве обеззараживают использованные бактериальные культуры, посуду. В этих случаях давление пара и экспозиция стерилизации должны быть продолжительнее (1,5 атм — 1 ч), чем при стерилизации чистого материала (0,5 атм — 30—40 мин.).

Пастеризация — метод, предложенный Пастером с целью сохранения питательной ценности пищевого продукта (молоко, мясные, рыбные и овощные консервы), которая снижается при кипячении (разрушаются витамины и другие нестойкие к действию высокой температуры вещества). При пастеризации продукт нагревают до 80 °С 30 мин, затем резко охлаждают (до 4—8 °С). Пастеризацией достигается частичная стерилизация — погибают вегетативные формы бактерий, а споры сохраняются. Резкое охлаждение и пос­ледующее хранение при низкой температуре (4—5 °С) препятствуют прорастанию спор и последующему размножению бактерий.

Стерилизация фильтрованием заключается в пропускании жидкого материала через бактериологические фильтры путем создания на фильтре перепада давления приложением повышенного давления к жидкости, находящейся над фильтром, либо путем создания вакуума в приемнике фильтрата. Действие фильтра состоит в механической задержке и в адсорбции микроорганизмов стенками пор фильтра. Размеры микробов часто бывают меньше среднего диаметра пор фильтров. Фильтруют обычно жидкости, не выдерживающие нагревание (сыворотки крови, растворы антибиотиков и др.). Фильтры бывают: твердые — керамические (цилиндрической формы в виде «свечей»), асбестовые (в виде пластинок), мембранные (с наиболее точной калибровкой пор).

Керамические фильтры (Шамберляна, Беркефельда, Ф₂, СФ) изготавливают из смеси каолина, кварцевого песка. Более широкое применение нашли фильтры Зейтца — плотные пластины, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой.

Мембранные фильтры (ультрафильтры), или коллодийные мембраны, представляют собой тончайшие листки из гемицеллюлозы, обработанной соот­ветствующими реактивами, температурой под прессом. Эти фильтры различают по диаметру и величине пор. Используют их для фильтрации, концентрации частиц, содержащихся в фильтруемом материале, а также для определения величины вирусных частиц.

Большей частью в работе используют фильтры Зейтца и мембранные фильтры, вмонтированные в специальном держателе-воронке, вставленном в пробку, закрывающую колбу Бунзена (толстостенная колба с тубусом). Стерильность полученных фильтратов прове­ряют посевом на питательные среды с последующим инкубированием в термостате в течение нескольких дней.

Стерилизация ультрафиолетовыми лучами. В лаборатории источником УФ-облучения обычно служат специальные бактерицидные лампы. Используют эти лучи для обеззараживания воздуха в помещениях (боксах, операционных). Бактерицидные лампы нашли также свое применение в пищевой промышленности при хранений различных продуктов (температура выше 0 °С).

Ультразвук, являясь физическим стерилизующим фактором, может быть использован, например, для обеззараживания воды, молока, некоторых продуктов, кожевенного сырья. Стерилизующее действие ультразвука связано с разрушением внутренних структур бактериальной клетки.

ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ стерилизации в лабораторной практике имеют ограниченное применение. Химические вещества (соли металлов, щелочи, антибиотики и др.) применяют для консервирования, с целью предупреждения бактериального загрязнения питательных сред, вакцин, а также лечебных и диагностических сывороток.

Питательные среды консервируют хлороформом, толуолом, иногда эфиром (для освобож­дения от консерванта среду нагревают до 56 °С).

Вакцины и лечебные сыворотки консервируют фенолом (0,25—0,5 %-ным), хлороформом (0,5%-ным), формалином (0,05%-ным) или мертиолатом (в конечной концентрации 1 : 5000—1 : 10 000).

Для консервирования агглютинирующих сывороток используют борную кислоту, толуол или глицерин.

Химические вещества применяют в лабораториях и для дезинфекции, которая направлена на уничтожение только патогенных микроорганизмов в окружающей среде.

Практическое задание 1: Изучить теоретический материал теме занятия.

Этапы выполнения задания:

1 Изучить классификацию питательных сред по происхождению, по назначению, по консистенции и др.

2 Усвоить требования, предъявляемые к питательным средам, методы стерилизации питательных сред.

3 Усвоить понятие и методы стерилизации, применяемые в бактериологической лаборатории.

4 Законспектировать теоретический материал по теме занятия.

Практическое задание 2: Приготовить питательные среды.

Этапы выполнения задания:

1 Определить и взвесить необходимое количество компонентов для приготовления 100 мл МПБ, 100 мл МПА.

2 Смешать необходимые компоненты в колбе, сварить среды, определить рН среды и подготовить их для стерилизации.

3 Расчеты компонентов среды представить преподавателю и отчитаться о проделанной работе.

Практическое задание 3: Подготовить стеклянную лабораторную посуду к стерилизации.

Этапы выполнения задания:

1 Определить чистоту лабораторной посуды и ее пригодность к стерилизации.

2 Завернуть чашки Петри, мерные пипетки, подобрать ватно-марлевые пробки к колбам, пробиркам.

3 Подготовленную к стерилизации посуду представить преподавателю, при одобрении выполненной работы разместить подготовленную посуду в сушильный шкаф под контролем лаборанта.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Поясните отличие понятий «стерилизация» и «дезинфекция». 2 Перечислите виды питательных сред по назначению. 3 На какие группы делят питательные среды по составу? 4 Поясните технику изготовления плотных питательных сред. 5 Каким требованиям должны соответствовать питательные среды? 6 Какие методы обеззараживания различных объектов применяют в микробиологической практике? 7 Какие значения рН являются оптимальными для выращивания бактерий, грибов, дрожжей? 8.Как определить показатель рН питательной среды?

 

⇐ Предыдущая1234567Следующая ⇒

Поделиться: