|
Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
|
|
Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
Москва, Новый Зыковский пр., д. 4а
Пособие для врачей-лаборантов По методам исследования Плазменного гемостаза ПРОТИВОСВЕРТЫВАЮЩАЯ СИСТЕМА, СИСТЕМА ФИБРИНОЛИЗА Москва, 2006 г. Составители:
Генеральный директор НПО «РЕНАМ», доктор биологических наук Козлов Альберт Анатольевич
зав. производством НПО «РЕНАМ», старший научный сотрудник, кандидат биологических наук Берковский Арон Леонидович
начальник ОТК НПО «РЕНАМ», старший научный сотрудник, кандидат биологических наук Качалова Наталья Дмитриевна
научный сотрудник НПО «РЕНАМ» Сергеева Елена Владимировна
ведущий научный сотрудник ГНЦ РАМН, кандидат биологических наук Простакова Татьяна Михапйловна
ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ_ 4 АНТИТРОМБИН III 4 Абильдгаард АТ III-тест. Клоттинговый метод Абильдгаард, первоначальный вариант 6 РеаКлот – АТIII тест. Клоттинговый метод Абильдгаард, упрощенный метод_ 7 РеаХром-АТIII тест Набор реагентов для определения активности антитромбина III фотометрическим методом_ 7 Интерпретация результатов_ 8 Аналитические характеристики наборов_ 8 СИСТЕМА ПРОТЕИНА С_ 9 Протеин С тест Набор реагентов для определения общей активности системы протеина С 11 Аналитические характеристики набора 12 Порядок применения 12 Интерпретация результатов_ 13 РеаХром-Протеин С тест Набор реагентов для определения активности протеина С фотометрическим методом_ 13 Аналитические характеристики набора 13 РеаРrC/FV тест Набор реагентов для определения резистентности активированного фактора V к протеину C_ 14 Интерпретация результатов_ 14 ГЕПАРИН И ГЕПАРИНОТЕРАПИЯ_ 14 РеаХром Гепарин Набор реагентов для определения анти-Xa активности гепарина фотометрическим методом_ 16 Аналитические характеристики набора 17 РеаКлот-Гепарин Набор реагентов для определения анти Ха активности гепарина коагулологическим методом_ 17 Интерпретация результатов. 18 Плазма-калибратор (3 уровня активности гепарина) 18 Плазма контрольная (2 уровня активности гепарина) 18 ФИБРИНОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КРОВИ_ 19 XIIa-зависимый фибринолиз Набор реагентов для определения фибринолитической активности плазмы крови человека_ 20 Интерпретация результатов анализа 20 Плазминоген_ 21 РеаХром-Плазминоген Набор реагентов для определения активности плазминогена фотометрическим методом_ 22 Интерпретация полученных результатов_ 22 Набор реагентов для определения растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) в плазме крови фенантролиновым методом (РФМК-тест) 22 Интерпретация результатов_ 23 Литература_ 23
ВВЕДЕНИЕ Процесс образования сгустков фибрина должен быть ограничен местом повреждения и не распространяться по организму. Для этого существуют специальные протеины, которые связываю и инактивируют сериновые протеазы коагуляционного каскада. Поэтому в ходе нормального гемостаза только небольшие количества факторов свёртывания в плазме превращается в активные протеазы или кофакторы. Скорость и степень генерации сериновых протеаз регулируется группой ингибиторов, протеинов, которые функционируют как природные антикоагулянты. Природные антикоагулянты позволяют локализовать свёртывание в месте повреждения и предупредить превращение процесса в системный. Этими природными антикоагулянтами в первую очередь являются антитромбин III и система протеина С. Физиологический инактиватор тромбина – антитромбин III, образующий комплекс тромбин-антитромбин, в присутствии гепарина способен инактивировать до 60% тромбина в плазме, оставшееся количество инактивируется менее специфическими ингибиторами (α 2 макроглобулин). Когда тромбин удаляется с места повреждения, он связывается с тромбомодулином на поверхности эндотелиальных клеток и теряет способность превращать фибриноген в фибрин. Комплекс тромбин-тромбомодулин активирует систему протеина С, которая инактивирует факторы VIIIa и Va, чем полностью блокирует свертывание. Система протеина С в свою очередь активирует систему фибринолиза, предназначенную для растворения образовавшихся сгустков фибрина. АНТИТРОМБИН III Одним из важнейших белков противосвертывающей системы является антитромбин III, который вместе с протеином С и некоторыми другими ингибиторами является главным регулятором гемостатического механизма. Антитромбин III - это D белок с молекулярной массой 60 000, который является членом семейства серпиновых или сериновых протеиназных ингибиторов, синтезируемых в печени, и связывающихся с инактивируемыми сериновыми протеазами через каскад свёртывания. Хотя название «антитромбин» обусловлено взаимодействием с тромбином, антитромбин III также инактивирует факторы XIIa, XIa, Xa и IXa путём связывания с сериновыми остатками активных центров этих протеаз. Кинетика взаимодействия может быть ускорена во много раз добавлением гепарина. Гепарин связывается с центрами антитромбина III, которые отличаются от региона, связывающего протеазы, и действует как аллостерический регулятор. После образования комплекса протеазы с антитромбином III гепарин высвобождается и может связываться с другими молекулами антитромбина III. Такое «каталитическое» ускорение активности антитромбина III гепарином названо гепарин-кофакторной активностью, которая требуется для полного антикоагулянтного действия гепарина в плазме. В ходе нормального гемостаза антитромбин III активируется путём связывания с гепариноподобными гликозаминогликанами (гепаранами), находящимися на поверхности эндотелиальных клеток. Антитромбин III - ингибитор всех сериновых протеаз, вовлеченных в процесс свертывания крови. Физиологическое значение антитромбина III подтверждает выраженная тенденция к тромбоэмболиям при врожденном дефиците ингибитора, встречающаяся в популяции с частотой 1: 5 000. Выделены 3 типа врожденного дефицита антитромбина III: снижение концентрации и функциональной активности, снижение только функциональной активности при нормальном содержании ингибитора, снижение только гепарин-кофакторной активности при нормальной активности и концентрации. Причинами приобретенного дефицита антитромбина III являются: снижение синтеза, пассивная потеря с биологическими жидкостями при кровопотере и повышенной сосудистой проницаемости, снижение за счет потребления при активации свертываюшей системы. Уменьшение синтеза антитромбина III отмечено при заболеваниях печени. В 1982 г было показано, что при всех формах дефицита антитромбина III возникает ДВС - синдром. Лечение и предупреждение дефицита антитромбина III возможно введением свежезамороженной плазмы. Однако при этом пациенту следует ввести не менее 1, 0 л свежезамороженной плазмы, что не всегда показано из-за риска возникновения недостаточности почек, сердца, отека легких. В этом случае лиофильно высушенный концентрат антитромбина III является препаратом выбора. Диагностические наборы для определения активности антитромбина III в плазме крови и в концентратах лечебного препарата – антитромбина III являются чрезвычайно актуальными и в нашей стране до последнего времени не производились. В настоящее время расшифрована первичная структура многих ферментов, что позволило искусственно синтезировать пептиды с аминокислотной последовательностью, аналогичной участкам субстратов, расщепляемых тромбином, плазмином и другими ферментами свертывающей системы крови. Сериновые протеазы свертывающей системы обладают достаточно узкой специфичностью в отношении белковых субстратов. Поэтому удалось синтезировать достаточно простые пептиды-субстраты и присоединить к конечным аминокислотным группам этих пептидов различные красители. Когда синтетический пептид (названный хромогенным субстратом) взаимодействует со специфическим ферментом, краситель высвобождается, и его количество можно измерить фотометрически. Таким образом, с помощью хромогенных субстратов можно измерить активность многих протеаз, участвующих в свертывании крови. Особенно часто этот метод применяется для определения активности антитромбина III. Следует помнить, что измерение амидолитической активности не является прямым измерением биологической активности факторов свертывания. Однако из-за простоты выполнения анализа амидолитические методы с применением хромогенных субстратов получили широкое применение в лабораторно-диагностических исследованиях. Для определения антитромбина III в плазме крови существуют много различных методов, преимущественно основанных на применении хромогенных субстратов. Компания РЕНАМ представляет 3 метода определения активности антитромбина III: клоттинговый метод Абильдгаард в двух модификациях и метод с хромогенным субстратом. Плазмы-калибраторы, входящие в состав наборов компании «РЕНАМ», аттестуются по зарубежным стандартным плазмам производства ведущих мировых фирм (Dade-Behring). Абильдгаард АТ III-тест. Принцип метода. Оценку активности антитромбина III в исследуемой плазме проводят по остаточной активности тромбина после его взаимодействия с антитромбином III в дефибринированной плазме. Определение активности антикоагулянта проводят по калибровочному графику, в котором время образования сгустка фибрина прямо пропорционально активности антитромбина III. Процесс стандартизуется проведением реакции при постоянной температуре (37°С). В тесте участвуют 3 плазмы: исследуемая (дефибринируется), плазма-калибратор с аттестованной активностью антитромбина III (дефибринируется) и фибриноген-плазма (в набор не входит, можно использовать любую плазму), являющаяся источником фибриногена. В исследуемой плазме крови тепловой обработкой удаляют фибриноген, вносят стандартное количество тромбина, содержащего инактиватор гепарина, смесь инкубируют и затем определяют в ней остаточную (после взаимодействия с антитромбином III) активность тромбина. Чем активнее антитромбин III в исследуемой плазме, тем меньше остаточная активность тромбина, и тем медленнее происходит образование сгустка. РеаКлот – АТIII тест. Принцип метода . Определяется остаточная активность тромбина после взаимодействия с антитромбином III. Возможное присутствие в исследуемой плазме гепарина (до 1 МЕ/мл) не влияет на измерение активности антитромбмна III благодаря присутствию в тромбине инактиватора гепарина. В отличие от первоначального варианта в состав набора включен усовершенствованный реагент тромбина, не требующий стабилизатора, а также специально приготовленный реагент фибриногена. Этот метод более прост по сравнению с первоначальным вариантом.
РеаХром-АТIII тест Принцип метода. Метод основан на способности антикоагулянта нейтрализовать тромбин в присутствии гепарина. Активность антитромбина III определяют в недефибринированной плазме, добавляя к ней избыток тромбина. При этом происходит ингибирование тромбина комплексом антитромбин III-гепарин пропорционально количеству антитромбина III в плазме. Оставшееся количество тромбина катализирует отщепление пара-нитроанилина (р NА) от синтетического хромогенного субстрата. Абсорбция свободного pNA, определяемая при 405 нм, обратно пропорциональна активности антитромбина III. Процесс идет по следующей схеме: АТIII + гепарин (избыток) Þ АТIII-гепарин. АТIII-гепарин + тромбин (избыток) Þ АТIII-гепарин-тромбин + тромбин (остаток). Субстрат-рNA + тромбин (остаток) Þ Пептид + рNA.
|
Последнее изменение этой страницы: 2019-03-30; Просмотров: 249; Нарушение авторского права страницы