Полимеразная цепная реакция, совмещенная с обратной транскрипцией

ПЦР проводили в амплификаторе «Amply 4» фирмы «Biokom».

Состав смеси ПЦР представлен в таблице.

Табл.2.6 Состав смеси для ОТ- ПЦР

Название	Концентрация, активность, количество в растворе
Taq Buffer (+(NH4)2SO4,-MgCl2) («Fermentas»)	1X
dATP	0,2 mM
dCTP	0,2 mM
dGTP	0,2 mM
dTTP	0,2 mM
MgCl2	2,5 mM
Primer f	0,4µM
Primer r	0,4µM
кДНК	100 ng
Taq Polymerase	2,5 U

 

Табл.2.7 Состав 10Х Taq Buffer.

Название	Концентрация в растворе
Tris-HCl (pH 8,8)	750 mM
(NH4)2SO4	200 mM
Tween 20 (v/v)	0,10%

 

Для предотвращения испарения ПЦР-смеси поверх нее капали 30 мкл минерального масла.

Параметры ПЦР, использованной во время постановки ПЦР:

1. Денатурация ДНК: Т=95^оС, 2 мин

2.1. Денатурация ДНК: Т=95^оС, 30 сек

2.2. Отжиг праймеров: Т=54^оС, 1 мин              30 циклов

2.3. Синтез: Т=72^оС, 1 мин

3. Синтез: Т=72^оС, 3 мин

Праймеры для ПЦР подбирали с помощью программы VectorNTI 9 (табл.2.8).

Табл. 2.8 Праймеры, использованные в ОТ - ПЦР.

Название	Последовательность 5’-3’ 5’-3’	Температура отжига	Размер продукта
ZAM_RT_f	aacggcatcaattgcatcaa	54	513
ZAM_RT_r	tgttggttctactctgcttg	54
17.6_RT_f	cctgcgtagcacgattttgt	54	536
17.6_RT_r	ctatgtccgccacaccagtt	54
297_RT_f	cgttggttcatacgccgaat	54	511
297_RT_r	ttcgacgtctgctactccgt	54
Transpac_RT_f	taacaagcgatccgatagtc	54	600
Transpac_RT_r	ctgagtccgcactgtgaata	54
Tirant_RT_f	ВПИШИ ПРАЙМЕРЫ	54
Tirant_RT_r	ВПИШИ ПРАЙМЕРЫ	54
Springer_RT_f	gacgtagttcgacagtttcc	54	500
Springer_RT_r	gccactattgtctgcgattt	54
Rover_RT_f	gcgacttaatagggttgtcc	54	494
Rover_RT_r	ttccgtgttacggtgttctg	54
Quasimodo_RT_f	gtagtagagactggctggaa	54	623
Quasimodo_RT_r	ttcgggagttgagctggaat	54
Opus_RT_f	ggaagcacatttgcaacgct	54	531
Opus_RT_r	ttgagcactgtggggcataa	54
Idefix_RT_f	gacatgggaaaaccgcaaga	54	500
Idefix_RT_r	acgatcttcctgccacgatt	54
Gypsy_RT_f	gtgaacgctattcactgcga	54	548
Gypsy_RT_r	gaggtgacagtttctgagtt	54

 

Электрофорез в агарозном геле.

Электрофорез проводили в агарозном геле. Для разных опытов использовался гель разной плотности. Состав геля представлен в табл. 2.9. Гель № 1 использовался в опытах анализы экспрессии МГЭ и для очистки зонда для Саузерн - блот гибридизации, гель №2 использовался в опытах анализы транспозиции МГЭ, гель №3 использовался для проверки качества РНК.

Табл. 2.9. Состав агарозного геля.

Название	Гель №1	Гель №2	Гель №3
Агароза	1%	0,7%	3%
Tris-acetate	40 mM	40 mM	40 mM
EDTA	1 mM	1 mM	1 mM
Ethidium bromide	0,01%	-	0,01%

Состав буфера для внесения проб в агарозный гель представлен в табл.2.10

Табл. 2.10 Состав буфера для внесения проб.

Название	Концентрация в растворе
Бромфеноловый синий	0,01%
SDS	0,5%
EDTA	0,1 М
Глицирин	50%

 

Напряженность электрического поля составляла 5 В/см.

Для определения линейной длины фрагментов использовался молекулярный маркер GeneRuler DNA Ladder Mix («Fermentas»).

Выделение ДНК из мух.

1. Мух в количестве 50 штук помещали в пробирку объемом 1,5 мл.

2. Гомогенизировали биологический материал с помощью тефлонового пестика до получения однородной массы в присутствии рабочего раствора (см. табл. 2.11).

Табл. 2.11 Состав рабочего раствора.

Название	Концентрация, кратность в растворе
Сток A	0,9X
SDS	1%
DEPC	1%

Табл. 2.12 Состав 1X Стока А.

Название	Концентрация в растворе
Tris HCl (pH 9,0)	0,1 M
EDTA	0,1 M

3. Инкубировали при температуре 70˚С 30 минут, добавили 5 М ацетат калия ( на 500 μl рабочего раствора 116 μl ацетата).

4. Инкубировали на льду 30 минут, центрифугировали 5 минут при 10g.

5. Добавили равный объем смеси фенола с хлороформом (1:1), центрифугировали 10 мин при 10 g.

6. Отобрали верхнюю фазу, добавили изопропанол (350 μl).

7. Инкубировали 7 минут при комнатной температуре, центрифугировали 15 минут при 10 g, супернатант сливали.

8. Добавляли 70% этанол (0,5 мл), центрифугировали 15 минут при 10 g, супернатант сливали.

9. Осадок просушивали, растворяли его в небольшом количестве воды Nuclease Free Water в зависимости от величины осадка (10-40 мкл).

10. Концентрацию ДНК измеряли с помощью спектрофотометра (фирма «Nanodrop»).

Рестрикция.

Рестрикцию проводили эндонуклеазами рестрикции фирмы “Fermentas” в специфических буферах, условия работы рестриктаз показаны в таблицах 2.13-2.19, состав рестрикционной смеси показан в таблице 2.20.

Табл. 2.13 Условия работы и инактивации эндонуклеаз рестрикции.

Название	Буфер, 1X	Температура реакции (⁰С)	Температура (⁰С) и время инактивации
SmaI	Tango	30	20', 65⁰
XhoI	R	37	20', 80⁰
KpnI	Unique	37	20', 80⁰
SacI	Unique	37	20', 65⁰
BamH1	Unique	37	20', 80⁰
PstI	O	37	20', 80⁰

 

Табл.2.20 Состав рестрикционной смеси.

Название	Кратность, количество, активность в растворе
Специфичный буфер	1X
ДНК	4000 ng
Рестриктаза	20 u

Лигирование.

Состав лигазной смеси показан в таблице 2.21.

Табл. 2.21 Состав лигазной смеси.

Название	Кратность, количество, активность в растворе
Буфер для Т4 ДНК-лигазы (Fermentas)	1X
ДНК	1000 ng
T4 ДНК-лигаза	10 U

 

⇐ Предыдущая123456789Следующая ⇒

Поделиться: