Общая схема эксперимента.

Общая схема эксперимента представлена на рисунке 3.1.

Рис. 3.1. Общая схема эксперимента.

3.2. Анализ экспрессии МГЭ группы Gypsy в линиях D . melanogaser .

Как было отмечено выше, транспозиционная активность gypsy контролируется геном flamenco по механизму РНК - интерференции. Не исключено, что этот ген контролирует транспозицию и других элементов этой группы. В поставленном нами эксперименте участвовали три изогенные линии, отличающиеся по гену flamenco (см. табл. 2.1.): MS (145), SS (7K), SS (C3( 19)), причем, в линии MS (145) присутствует активный ретровирус gypsy.

Первым этапом в цепи событий, происходящих при транспозиции ретроэлементов, является их транскрипция, в результате чего образуется РНК, часть которой используется как матрица для обратной транскриптазы, другая часть подвергается сплайсингу и транслируется. Если транскрипции элемента не происходит (например, элемент дефектный) или происходит деградация транскрипта сразу после его синтеза (РНК- интерференция), то последующие процессы - образование кДНК и ее интеграция в геном, невозможны. Таким образом, транскрипция является одним из лимитирующих факторов в процессе перемещения ретроэлементов. В связи с этим, мы охарактеризовали нашу модельную систему – изогенные линии D . melanogaster 7К, 145 и С3, с точки зрения наличия или отсутствия транскриптов одиннадцати элементов группы Gypsy: rover , 17,6, 297, Idefix , Quasimodo , Transpac , Tirant , Zam , gypsy , springer , opus.

Схема эксперименты анализа экспрессии показана на рисунке 3.3.

Рис.3.3. Схема эксперимента анализа экспрессии элементов.

Результаты анализа экспрессии элементов представлены на 3.4.-3.9. В качестве референсного гена использовался ген rp49, который экспрессируется конститутивно.

Рис. 3.4. Результаты экспрессии МГЭ по самцам линии SS(7K)

 

 

Рис. 3.5. Результаты экспрессии МГЭ по самкам линии SS(7K)

Рис. 3.6. Результаты экспрессии МГЭ по самкам линии SS(С3(19))

Рис. 3.7. Результаты экспрессии МГЭ по самцам линии SS(С3(19))

Рис. 3.8. Результаты экспрессии МГЭ по самцам(7) линии MS(145)

Рис. 3.9. Результаты экспрессии МГЭ по самкам(8) линии MS(145)

Элемент Zam во всех линиях и элемент Tirant в линии SS(7K) очень слабо экспрессировались, транскрипты остальных элементов детектировались достаточно уверенно. Наличие РНК элементов говорит об их гипотетической способност к транспозиции.

3.3. Анализ транспозиции МГЭ группы Gypsy в линиях D . melanogaser .

Для дальнейшей характеристики изучаемых линий была проанализирована транспозиционная активность в линиях, мутантных по гену flamenco: MS (145) и SS (7K). В эксперименте изучались 11 МГЭ, представленных на рисунке 3.2. Эксперимент проходил в два этапа. Схема первого этапа эксперимента изображена на рисунке 3.10.

Рисунок 3.10. Схема эксперимента анализа трансозиции МГЭ (этап I).

В результате для элементов: Zam , Idefix, rover, springer, gypsy, 17,6 (см. Приложение 1) в изогенных линиях MS(145) и SS(7K) были получены отличающиеся ПЦР – фрагменты. Для подтверждения специфичности продуктов был поставлен второй этап эксперимента: Саузерн- блоттинг (рис.3.11.).

Рис.3.11. Схема эксперимента анализа транспозиции МГЭ (этап II – Саузерн-блоттинг)

Специфичность ПЦР- фрагментов была подтверждена для элементов : rover (см. рис. 3.12., 3.13.), springer (3.14.), gypsy (рис.3.15.).

Рис. 3.12. Результаты анализа транспозиции по элементу rover, полученные с использованием рестриктазы SmaI

Рис. 3.13. Результаты анализа транспозиции по элементу rover, полученные с использованием рестриктазы KpnI

Как видно из рисунков 3.6. и 3.7. в изогенных линиях MS(145) и SS (7K) имеются различные ПЦР – фрагменты, то есть копии элемента rover, имеющие различное геномное окружение. На рисунке 3.6. в линии MS(145) ПЦР-фрагмент размером 3000 п.н., отсутствующий в линии SS (7K), а на рисунке 3.7. в линии MS два ПЦР- фрагмента, размерами 2000 п.н. и 1600 п.н. Это говорит о том, что элемент(ы) rover перемещались по геному, то есть о том, что они имеют транспозиционную активность в этих линиях.

Рис. 3.14. Результаты анализа транспозиции по элементу springer, полученные с использованием рестриктазы PstI

Как видно из рисунка 3.8. в линии SS(7K) присутствует ПЦР-фрагмент, размером около 8000 п.н., отсутствующий в линии MS(145). Это указывает на то, что элемент springer имеют транспозиционную активность в этих линиях.

Рис. 3.15. Результаты анализа транспозиции по элементу gypsy, полученные с использованием рестриктазы SmaI

Как видно из рисунка 3.9., в линии MS (145) присутствует ПЦР-фрагмент размером около 3000 п.н., отутствующий в линии SS (7K). Эти линии изогенны, но отличаются в наличие в линии MS(145) активной формы gypsy. Поэтому данный результат лишь подтверждает тот факт, что в линии SS (145) gypsy перемещается.

Для остальных элементо (Idefix , Zam , 17,6, 297, opus , tirant , transpac , quasimodo) таким способом не получилось показать наличие транспозиционной активности в этих линиях. Однако, это не означает, что данные события не происходят, либо происходят крайне редко, и в рамках используемого подхода не обнаруживабтся.

⇐ Предыдущая123456789Следующая ⇒

Поделиться: