Основные принципы взятия и пересылки вируссодержащего (патологического) материала

В условиях хозяйств удается сделать лишь предварительное заключение о причине болезни. Окончательный диагноз устанавливается на основании результатов исследования вирусологической лаборатории, суть которых состоит в обнаружении возбудителя болезни и его идентификации. Точность диагноза, прежде всего, зависит от правильности взятия вируссодержащего (патологического) материала, его транспортировки и подготовки для исследования.

Все правила взятия, консервирования и пересылки патологического

(вируссодержащего) материала отражены в ветеринарном законодательстве т. 2 стр. 155.

Основные принципы взятия и пересылки вируссодержащего (патологического)материала сводятся к следующему:

1. При выборе вида патологического материала учитывают места размножения (тропизм) вируса в организме, пути выделения вируса из организма, стадию течения болезни, видимые клинические и патолого-морфологические признаки, предполагаемый диагноз. Так, при подозрении на ящур направляют афты, при диагностике бешенства – голову. Материалом для исследования могут быть корочки и пустулы (оспа), слизистые истечения и смывы с носоглотки (парагрипп), испражнения (при желудочно-кишечных инфекциях), кровь (при пантропных заболеваниях). От трупов берут кусочки паренхиматозных органов ( печени, легких, лимфатических узлов, селезенки, почек) слизистых оболочек, мышечной ткани, головного мозга в зависимости от тропизма вируса.

2. Отбор проб от больных животных необходимо производить как можно раньше после появления первых клинических признаков, т. е. в начале заболевания или даже. если возможно. в инкубационный период. В это время количество вируса в организме максимальное, а по мере развития инфекционного процесса количество вируса уменьшается в результате воздействия защитных сил организма.

3. От павших и вынужденно убитых животных направляют только свежий материал, взятый в первые часы после гибели (1-2 часа). После смерти животного исчезает барьерная роль кишечника, и микрофлора быстро распространяется по организму, а также начинается аутолиз тканей. В результате чего вирус погибает.

4.При взятии материала соблюдают стерильность, так как разложение тканей под действием микрофлоры приводит к образованию токсичных продуктов, которые вызывают гибель живой системы, на которой будут выделять вирус в лаборатории.

5.Патологический материал для вирусологических исследований берется в небольших объемах. Из различных органов, соблюдая стерильность, вырезают кусочки весом 1, 5-2 гр. Их помещают в контейнер ( флакон из под антибиотиков). Слизь, истечения, соскобы, тампоны пропитанные жидким патматериалом погружают в раствор Хенкса или Эрла с антибиотиками (пенициллин 1000 ЕД, стрептомицин 500 ЕД, нистатин 20 ЕД на 1 мл). К каждому контейнеру прикрепляют этикетку из лейкопластыря, на которой указывают простым карандашом вид животного, какой материал и дату. Контейнер заворачивают в бумагу или вату, затем, во влагонепроницаемый материал (полиэтилен) и после этого помещают в герметичный ящик, который опечатывают.

6.Если патологический материал невозможно немедленно доставить в лабораторию, то его необходимо законсервировать. Самым эффективным способом консервирования является замораживание. С этой целью наиболее удобно использовать термос, содержащий 100 весовых частей льда и 33 части натрия хлорида. В результате в термосе сохраняется температура -15º - 20º С. Для создания более низкой температуры (- 70º С) используют смесь равных объемов твердой углекислоты и этилового спирта. Для консервирования вируссодержащего материала применяют также химический способ. В качестве консерванта используют смесь равных объемов химически чистого глицерина и фосфатно-буферного раствора. Смесь предварительно стерилизуют в автоклаве при 120 º С 30 мин. Данный способ применяют в основном для консервирования кусочков ткани.

7.К патологическому материалу прилагают сопроводительное письмо, в котором указывают все необходимые сведения о посланном материале, в том числе и предварительный диагноз. Подготовленный патологический материал направляют в вирусологическую лабораторию с нарочным, человеком, получившим соответствующий инструктаж.

Часто патологический материал одновременно отправляют в бактериологическую лабораторию для исключения бактериальных инфекций.

При поступлении вируссодержащего материала в вирусологическую лабораторию, в приемной сотрудник лаборатории регистрирует его в журнале «Вирусологические исследования» и в соответствии с сопроводительным документом составляет план исследования на ту вирусную инфекцию, которая указана в качестве предварительного диагноза.

В комнате предварительной обработки, поступивший материал распечатывается с соблюдением всех правил техники безопасности, и отбирается в необходимом количестве для исследования в соответствии с планом.

Подготовка вируссодержащего (патологического) материала для исследования

Из патологического материала делают мазки, мазки-отпечатки, гистосрезы и почти всегда вируссодержащую суспензию. Вируссодержащую суспензию используют для обнаружения вируса различными методами, для биопробы и выделения живого вируса на биологических системах (животные, куриный эмбрионы, клеточные культуры).

Суть получения вируссодержащей суспензии – освободить вирус из клеток и перевести его в жидкую среду (раствор Хенкса, физиологический раствор и т. д.).

 

Приготовление вируссодержащей суспензии состоит из этапов:

1.Удаление если есть консерванта и взвешивание патологического материала.

2.Освобождение вируса из клеток путем перетирания тканей в ступке с песком, на гомогенезаторе или многократным замораживанием и оттаиванием

3.Полученную массу разводят раствором Хенкса или Эрла 1: 5 или 1: 10.

4.Предварительную очистку суспензии осуществляют отставанием или центрифугированием при 2-3 тыс. об/мин. в течение 15-20 мин.

5.Освобождение суспензии от бактерий, спор бацилл и грибов проводят с помощью разных методов:

а) Добавлением в вируссодержащую суспензию антибиотиков. Из антибиотиков наиболее часто используют пенициллин и стрептомицин (действуют на бактерии), нистатин (на грибы) и тетрациклин (на микоплазмы). Они не токсичны для живых систем. Антибиотики в соответствующих дозах (пенициллин 1000 ЕД, стерптомицин 500 ЕД, нистатин 30 ЕД, тетрациклин 100 мкг на 1 мл) вносят в предварительно очищенную суспензию и выдерживают не менее 30-60 мин при комнатной температуре.

б) Фильтрацией вируссодержащей суспензии через бактериологические фильтры. Для этого применяют стерилизующие фильтры с диаметром пор 100-400 н. Фильтры изготавливают из различных пористых материалов. Керамические фильтры (свечи Шамьерлана, Беркефельда, Ленинградского ГНИИК и др.) готовят из каолина, асбестовые – из прессованного асбеста, коллодиевые – из нитроклетчатки, стеклянные (фильтры Шота, ГДР) — из мельчайших гранул стекла. Фильтрование жидкостей производят с помощью вакуума или давления. Фильтрация является физико-химическим процессом, при котором происходит адсорбция противоположно заряженных частиц, в том числе и вирусов. И при низкой концентрации вируса в суспензии он может весь остатся на фильтре. Поэтому этот способ очистки от посторонней микрофлоры применяют редко.

в) Высокоскоростным центрифугированием (до 10 тыс. об/мин). При этом способе очистки применяют рефрижераторные центрифуги, чтобы сохранить активность вируса. Во время высокоскоростного центрифугирования происходит осаждение всех микроорганизмов, кроме вирусов, а также оседают все разрушенные клетки. Данный способ применяется наиболее часто.

5. Контроль вируссодержащей суспензии на наличие оставшихся микроорганизмов осуществляют путем посева на питательные среды (МПБ, МППБ, среда Сабуро).

При отрицательном результате бактериологического контроля вируссодержащую суспензию используют для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов и клеточных культур.

 

Задание 1. Приготовить вируссодержащую суспензию из патологического материала.

Этапы выполнения задания

1 Подготовить оборудование: вируссодержащий материал в контейнере, пинцет, ножницы, стерильная ступка с пестиком, пробирка со стерильным кварцевым песком, пробирка с раствором Хенкса, центрифужная пробирка, пустая пробирка с пробкой, флаконы с антибиотиками, 2 пипетки на 1-5 мл, спиртовая горелка, банка с дез. раствором, кювета с 5-ти слойной марлевой салфеткой пропитанной дез. раствором, спиртовые тампоны, питательные среды (МПА, МПБ, Сабуро), резиновые перчатки, марлевые повязки.

2 Проверить присланный патологический материал на соответствие правилам взятия, консервирования и пересылки патологического (вируссодержащего) материала, изложенным в ветеринарном законодательстве т. 2 стр. 155.

3 Распаковать вируссодержащий материал, соблюдая правила техники безопасности (над кюветой).

4 Приготовить вируссодержащую суспензию из данного материала.

 Материал поместить в ступу, в которую предварительно высыпать стерильный песок, тщательно растереть, добавить раствор Хенкса в соотношении 1: 10.

4.1 Полученную суспензию перелить в центрифужную пробирку и центрифугировать при 5 тыс. об/мин 2 минуты.

4.2 Суспензию осторожно перелить в чистую пробирку, добавить растворы антибиотиков (пенициллин 1000 ЕД, стерптомицин 500 ЕД, нистатин 30 ЕД)и выдержать 30 минут.

4.3 Проверить на стерильность. Сделать посев суспензии на скошенный МПА и на МППБ, среду Сабуро.

4.4 Посевы поместить в термостат.

Вопросы и задания для контроля знаний

1 Как производят отбор материалов для вирусологического исследования?

2 Перечислите способы консервирования и правила транспортировки вируссодержащего материала.

3 Дайте определение вируссодержащей суспензии и для чего ее готовят

4 Укажите этапы приготовления вируссодержащей суспензии.

 5 Как освобождают вируссодержащую суспензию от посторонней микрофлоры?

 

 Тема3 « использование в вирусологии куриных эмбрионов»

Занятие 1 « Применение куриных эмбрионов в вирусологии и методы заражения»

Цель- формирование знаний о применении куриных эмбрионов в вирусологии и навыков заражения развивающихся куриных эмбрионов вирусной суспензией.

Материальное обеспечение

Куриные эмбрионы (КЭ), вируссодержащий материал (вакцинный штамм вируса нъюкаслской болезни птиц), пробойники, подставка под КЭ, спиртовые тампоны, парафин, спиртовые горелки, овоскоп, простые карандаши, йодированный спирт, факел, банка с дез. раствором, кюветы с 5-ти слойной марлевой салфеткой, пропитанной дез. раствором, перчатки резиновые, повязки. Плакаты: схема строения куриного эмбриона, методы заражения куриного эмбриона, инкубатор.

План

1 Применение развивающихся куриных эмбрионов в вирусологии.

2 Строение куриного эмбриона.

3 Правила и способы заражение развивающегося куриного эмбриона.

123456Следующая ⇒

Поделиться: