Виды монослойных культур клеток, применяемых ввирусологии

Выращивают монослойные культуры клеток в термостате при температуре 37С.

В своей жизни культура клеток проходит 4 фазы:

1 адаптации – длится несколько часов. Клетки оседают на дно, прикрепляются к твердой основе и привыкают к новым условиям;

2 логарифмического роста – клетки размножаются, образуя островки роста, и покрывают твердую основу слоем в одну клетку до контакта друг с другом. Обычно монослой формируется 3-5 дней, что зависит от вида ткани и условий культивирования;

3 стационарная – в это время клетки только осуществляют обменные процессы. При условии периодической смены питательной среды монослой может жить 7-21 день

4 старения – клетки погибают – монослой разрушается.

Субкультуры – это второе и несколько последующих поколений первично-трипсинизированной культуры клеток. Получают их путем пересева выросшего монослоя первичной культуры. Для этого:

1) сливают ростовую питательную среду из сосуда с первичной культурой клеток;

2) монослой заливают диспергирующим раствором и помещают в термостат ( 37 С) на 20 -30 минут, переодически встряхивая;

3) полученную суспензию клеток центрифугируют и надосадочную жидкость (диспергирующий раствор) сливают;

4)осадок клеток ресуспендируют в ростовой питательной среде, подсчитывают их количество и разводят до посевной концентрации. Суспензию клеток разливают в новые сосуды и помещают в термостат. Вновь выросший монослой клеток и называется субкультура.

Таким образом, можно получить до 8 поколений субкультуры. Далее морфология клеток изменяется, и они гибнут.

Первичные культуры клеток и субкультуры обладают свойствами и структурой той тркани, из которой получены поэтому высоко чувствительны к вирусу. Но субкультуры более экономичны, так как не требуют каждый раз нового получения, а пересевы субкультуры дают возможность выявить контаминацию клеток вирусами.

Диплоидные культуры клеток - это клетки, выдерживающие 50±10 пересевов, сохраняя диплоидные набор хромосом. Диплоидные культуры получают из первичных культур клеток путем их многократных пересевов и селекции соответствующих линий, используя, высококачественные питательные среды и особые условия выращивания.

Диплоидные культуры обладают всеми преимуществами первичных и субкультур и, кроме того, сохраняют жизнеспособность без смены питательной среды 10-12 дней. Поэтому они особенно пригодны для длительного культивирования вирусов.

Перевиваемые культуры клеток – это клетки способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В отличие от других, клетки этих культур содержат гетероплоидный набор хромосом и имеют одинаковую форму.

Для получения перевиваемых культур клеток используют здоровые и опухолевые ткани.

Из них получают первичные культуры клеток, а затем перевиваемые путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Полагают, что механизм происхождение этих культур – результат генетической изменчивости клеток или результат селекции отдельных клеток исходной культуры.

Перевиваемые культуры клеток можно выращивать не только в виде монослоя, но и во взвешенном состоянии в виде суспензии. Такие культуры называются суспензионными. Для их выращивания используется специальная аппаратура, которая поддерживает определенную температуру, рН и скорость перемешивания суспензии. Такой способ выращивания позволят получать большую массу клеток, чем при других способах выращивания, что открывает большие возможности для получения вирусной массы.

Наиболее широко используются в вирусологии, такие перевиваемые культуры клеток, как Hela (из раковой опухоли шейки матки женщины), Нер – 2 (из карциномы гортани человека), ВНК – 21 (почка новорожденного хомячка), ТR –из слизистой трахеи коровы и другие.

Преимуществаперевиваемых культур перед другими:

- однократное получение из ткани организма;

- простое приготовление (пересев) и быстрое формирование монослоя;

- широкий спектр чувствительности;

- обеспечивают стандартные условия размножения вирусов, так как представляют одинаковые клетки (клоны), а в других видах культур находятся разные популяции клеток;

- легко проверить культуру на контаминацию микроорганизмами;

- возможность выращивания в суспензии и соответственно получение большой массы вируса.

К основным недостаткам перевиваемых культуротносится:

1 малигнизация- злокачественное перерождение клеток независимо от происхождения, поэтому перевиваемые культуры нельзя использовать для приготовления вакцин;

2 быстрее, чем у первичных культур происходит снижение чувствительности к вирусам;

3 необходимы частые перевесы раз в 2-3 дня для поддержания жизнеспособности культуры.

 

        2 Условия выращивания культур клеток

Наиболее важным условием для получения, выращивания и поддержания клеточных культур являются питательные среды.

Среды должны содержать все необходимые для жизнедеятельности клеток питательные вещества: аминокислоты, углеводы, витамины, факторы роста, макро- и микроэлементы.

Основой питательных сред являются солевые растворы. Они должны обеспечивать клетки ионами натрия, калия, магния, кальция, карбонатов и фосфатов, хлоридов. Все компоненты должны содержатся в тех же количествах, что и в сыворотке крови. Солевые растворы должны создавать необходимое осмотическое давление, поддерживать постоянную рН. Для приготовления солевых растворов используют только соли с маркой «ЧДА», которые растворяют последовательно в дистиллированной воде с учетом совместимости. Основные солевые растворы применяемые в вирусологии: раствор Хенкса, Эрла, фосфатно-буферный раствор.

Питательные среды по характеру входящих компонентов делят на 2 группы:

1 Среды, содержащие естественные компоненты.

Кроме солевого раствора в такую среду входит сыворотка или амниотическая жидкость или эмбриональный экстракт или смесь этих компонентов. Эти среды обеспечивают как размножение клеток, так и поддержание их жизнедеятельности.

2 Синтетические и полусинтетические среды.

Полусинтетические среды это ферментные гидролизаты белковых веществ в солевом растворе. К ним относятся гемогидролизат, гидролизат лактальбумина, аминопептид и другие.

Гемогидролизат это 5 % гидролизат сгустков крови. Аминопептид это гидролизат белка – прозрачный раствор с желтоватой окраской, содержащий 4-5 % аминокислот и пептидов.

Наиболее широкое применение в практике имеют синтетические среды, которые изготавливают путем смешивания компонентов в необходимых количественных соотношениях. К ним относятся среды 199 и Игла. Среда 199 является сложной по химическому составу. Она содержит 60 различных составных частей, в том числе 20 аминокислот, 17 витаминов, 8 минеральных солей, 10 видов фрагментов нуклеиновых кислот, глюкозу и др. Такой же сложный состав имеет и среда Игла. Во всех средах для контроля рН присутствует индикатор феноловый красный. Для обеспечения стерильности в период использования сред, в них добавляют антибиотики, нетоксичные для культкры клеток.

Вторая группа сред подразделяется на две подгруппы по назначению:

1 поддерживающие- среды, которые поддерживают клетки в жизнеспособном состоянии в течение короткого времени;

2 ростовые — среды, обеспечивающие рост и размножение клеток. Отличаются эти среды от поддерживающих наличием эмбриональной сыворотки крови животных (5-10 % от объема среды).

Диспергирующие растворы

Эти растворы применяются для получения и пересева культур клеток.

1 0, 25-0, 3 % раствор протеолетического фермента (трипсина или хемотрипсина). Он расщепляет межклеточные белки, что обеспечивает разделение монослоя или ткани на отдельные клетки. Наиболее активен при 37º С рН 7, 2-7, 4.

2 0, 02 % раствор версена (двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, трилон В и ЭДТА) – снимает монослой клеток от стекла. Механизм действия основан на связывании двухвалентных катионов кальция и магния, которые способствуют закреплению клеток на твердой основе, в результате чего клеточный слой отделяется от твердой основы. В работе чаще используют смесь этих растворов.

⇐ Предыдущая123456Следующая ⇒

Поделиться: