Индикация вирусов в зараженных клеточных культурах

Размножение вирусов в зараженных клеточных культурах установливают по следующими признакам:

1 Цитопатогенное действие вирусов на клетки монослоя (цпд). Ццитопатогенным действием (цпд) принято называть любые видимые под световым микроскопом изменения в клетках монослоя, вызванные репродукцией вирусов.

Внешние признаки цпд разнообразны и зависят от биологических свойств различных вирусов. По общим признакам цпд принято делить на 5 основных видов:

а) Фрагментация клеток и образование клеточного детрита (вызывается пикорновирусами)

б) Симпластообразование. Симпласты это в гигантские многоядерные клетки, образовавшиеся в результате разрушения клеточных оболочек и слияние цитоплазм под действием вируса (вызывается герпесвирусами, парамиксовирусами)

в) Округление клеток и отслаивание погибших клеток от стекла, в результате потери способности клеток прикрепляться к твердой основе под действием вируса (вызывается парвовирусами, аденовирусами)

г)вакуолизация- образование пустот в цитоплазме клеток (ретровирусы)

д) Трансформация клеток в опухолевые – в монослое образуются плотные фокусы, состоящие из клеток различной формы и величины (вызывается ретровирусами).

Оценку цпд проводят только в сравнении с контролем (не зараженная аналогичная культура клеток).

2 Приобретение способности клеток монослоя, зараженных гемагглютинирующими вирусами, адсорбировать эритроциты. Определяют путем постановки реакции гемадсорбции (РГАд) с культурой клеток. Для этого:

а) Из пробирок с зараженной культурой клеток сливают питательную среду и вносят 0, 2 мл 0, 5 % взвеси эритроцитов в растворе Хенкса.

б) Пробирки выдерживают 15-20 минут при комнатной температуре.

в) Монослой клеток ополаскивают раствором Хенкса и микроскопируют. В положительном случае вокруг инфицированных клеток обнаруживают адсорбированные эритроциты.

Данная реакция позволяет обнаружить репродукцию вируса еще до появления ЦПД. Так культура клеток, зараженная вирусом гриппа адсорбирует эритроциты очагами. При заражении вирусом парагриппа-диффузно. А при заражении вирусом африканской чумы образуется «ожирелье» из эритроцитов по перефирии клеток.

3 Образование бляшек. Для обнаружения вирусов в культуре клеток используют метод бляшек по Дюльбекко (тогавирусы, пикорнавирусы, герпервирусы). Для этого на монослой клеток наносят вирусную суспензию и выдерживают 2 часа при комнатной температуре, а затем вносят поддерживающую питательную среду, содержащую 1 % агара и индикатор нейтральрот. После застывания среды сосуд с зараженной культурой клеток помещают в термостат. Под слоем плотной среды клетки остаются живыми 10-12 дней. При репродукции вирусов в монослое образуются островки из мертвых клеток. Индикатор, находящийся в среде над живыми клетками окрашивается ее в красный цвет, а над мертвыми клетками не изменяет. В результате на красном фоне образуются светлые пятна, получившие название бляшки. Считают, что каждая бляшка образуется в результате репродукции одной вирусной частицы.

4.Обнаружение вируса в культуральной жидкости или в клетках монослоя под электронным микроскопом

5 Образование внутриклеточных телец-включений. Смотри тему «Индикация вирусов в патологическом материале микроскопическими методами».

6 Наличие вирусных антигенов в культуральной жидкости или в зараженной культуре клеток, выращенной на покровных стеклах, обнаруживаемых с помощью метода флуоресцирующих антител (МФА) или иммуноферментного анализа (ИФА). Смотри тему: «Люминесцентная микроскопия, иммуноферментный анализ (ИФА) и их использование в вирусологии»

Задание 1 Провести заражение культуры клеток в пробирках

вирусной суспензией.

Этапы выполнения задания

1Записать в тетрадь технику заражения монослойных культур клеток.

2 Подготовить оборудование: пробирка с вирусной суспензией, две пробирки с культурой клеток, пробирка с раствором Хенкса, пробирка с поддерживающей средой, две пипетки, груша, банка с дез. раствором, спиртовка, подставка для пробирок.

3 Выполнить по порядку все этапы техники заражения культуры клеток

 

Задание 2 Определить вид цитопатического действия (ЦПД )вируса на музейных препаратах культур клеток.

Этапы выполнения задания

1 Изучить с помощью микроскопа музейные препараты с культурами клеток (первичной, субкультурой, перевиваемой, диплоидной)

2 Определить вид ЦПД (деструкция, симпластообразование, трансформация).

3 Зарисовать в тетрадь.

Вопросы и задания для контроля знаний

1Что происходит с клетками после их посева?

2 Какая питательная среда применяется для выращивания монослоя?

3Условия выращивания клеточных культур.

4.Какими методами можно обнаружить вирусы в зараженных клеточных культурах?

5 Какое действие вирусов называют цитопатогенными?

6 В чем состоит сущность реакции гемадсорбции?

7 В чем заключается метод индикации вирусов по их способности образовывать бляшки?

 

  ТЕМА 5 «ИНДИКАЦИЯ ВИРУСОВ В ПАТОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ»

Цель - закрепление знаний о методах выявления присутствия вируса в патологическом материале по наличию вирионов и вирусных телец-включений и формирование навыков вирусоскопии (обнаружения вируса оспы в патматериале )

 

                                     Материальное обеспечение

Музейные препараты с тельцами Бабеша-Негри, вирусом оспы, световые микроскопы, электронный микроскоп, металлические опорные сетки (100 ячеек в 1 мм2), объектодержатель, набор реактивов для окраски по Морозову, дистиллированная вода, чашки Петри, препараты -мазки из оспенного материала, фильтровальная бумага, пинцеты, фотографии вирусов, рисунки элементарных телец оспы, телец-включений

                                             План

1 Использование светового микроскопа в диагностики вирусных инфекций.

2 Применение электронного микроскопа в вирусологии.

3 Окрашивание мазков- препаратов методом по Морозову для диагностики оспы кур.

 

1 Использование светового микроскопа в диагностики вирусных инфекций

Микроскопические методы диагностики вирусных инфекций основаны на использовании светового, электронного и люминесцентного микроскопов.

Люминесцентный микроскоп в вирусологической практике применяется в двух методах исследования: при простом флуорохромировании и в методе флуоресцирующих антител – МФА.

Возможности световой микроскопии ограничены из-за низкой разрешающей способности, поэтому ее применяют лишь в следующих случаях:

1Для обнаружения вирусных телец-включений в зараженных вирусом клетках.

2 Для обнаружения крупных вирионов.

3 Для изучения действия вирусов на клеточные культуры (цитопатическое действие).

     Обнаружение вирусных телец-включений

Тельца-включения это такие образования, которые обнаруживают в клетках тканей организма при ряде вирусных инфекций (бешенство, аденовирсуная инфекция, оспа, болезнь Ауэски, чума собак и др.).

По происхождению они представляют:

а) скопления зрелых вирионов в местах их сборки;

б) клеточный материал, измененный в процессе репродукции вирусов или избыток вирусных белков, не вошедших в состав вирионов

в) комбинация этих элементов (чаще всего).

По расположению в клетке тельца-включения могут быть: внутриядерными (образуют в основном ДНК-содержащие вирусы), цитоплазматическими (образуют РНК-содержащие вирусы) и реже, одновременно теми и другими. В зависимости от вида вируса эти образования отличаются формой, размерами, структурой, количеством, особенностью окрашивания. Поэтому обнаружение их в патологическом материале свидетельствует о пребывании вируса в организме животного, от которого взят этот материал, что имеет важное диагностическое значение.

Для обнаружения телец-включений из исследуемого материала готовят мазки или мазки отпечатки (посмертно или прижизненно), которые подвергают специальным методам окрашивания с последующей микроскопией.

Наиболее часто метод обнаружения телец-включений используют при диагностике бешенства. Для этого из всех отделов головного мозга готовят мазки или отпечатки фиксируют и окрашивают по Муромцеву, Селлерсу или Манну. В положительных случаях в цитоплазме нервных клеток обнаруживают тельца-включения. Они резко очерчены, фиолетового цвета с розовым оттенком или красные (в зависимости от метода окраски), с хорошо выраженной дольчатостью. Фон и цитоплазма клеток бледно-голубые, ядра синие, эритроциты оранжево-красные. Тельца- включения, обнаруживаемые при бешенстве, называют тельца Бабеша-Негри по именам, открывших их ученых.

Обнаружение крупных вирионов.

Метод обнаружения вирионов в патологическом материале с помощью световой микроскопии называется вирусоскопия.

С помощью светового микроскопа могут быть обнаружены только крупные вирусы размеры, которых превышают 300-400 нм. Поэтому вирусоскопию используют при диагностике оспы.

С этой целью используют специальные методы окраски, позволяющие искусственно увеличить вирусную частицуза счет адсорбции металла на поверхности вириона и повысить контрастность микрокартины. Лучшим методом является окраска препаратов аммиачным серебром по Морозову. Для этого из оспенных поражений кожи готовят мазки, мазки-отпечатки. Их высушивают на воздухе и окрашивают по методу Морозова.

В положительном случае при микроскопировании видны на желтом фоне очень мелкие округло-овальной формы темно-коричневые тельца, лежащие группами, рядами или скоплениями, но не одиночно. Это вирионы вируса оспы, которые называют — элементарные тельца.

 

2 Применение электронного микроскопа в вирусологии

Электронный микроскоп в вирусологических исследованиях применяется широко, так как увеличивает изучаемый объект до 2 000 000 раз и позволяет различать объекты размером до 0, 14 нм. Этот микроскоп дает возможность увидеть вирусы – т. е. обнаружить их в патматериале, что имеет диагностическое значение; изучить форму, размеры и строение вирионов, а так же процессы взаимодействия вируса с живой клеткой и другими объектами (антителами, эритроцитами).

Первый электронный микроскоп был создан в 1931 году немецкими учеными Кноль и Руска. Основанием для создания электронного микроскопа явилось открытие волновой природы электронного излучения и возможности управления электронным потоком, с помощью электромагнитного поля.

Принципы строения электронного микроскопа аналогичен световому, только роль оптических линз выполняют электромагнитные катушки, а вместо потока света используется поток электронов в глубоком вакууме.

Источником потока электронов является катод. Он представляет собой вольфрамовую нить которая при подаче высокого напряжения (до сотен тысяч вольт) сильно нагревается и выделяет электроны. Они устремляются к аноду, имеющему в центре отверстие. Электроны проходят через это отверстие с ускорением, формируя электронный поток. Он фокусируется конденсорной электромагнитной катушкой и направляется на исследуемый объект. В зависимости от электронно-оптической плотности препарата, часть электронов проходит через объект, другие отклоняются или задерживаются, выбывая из электронного потока. В результате формируется первичное изображение, которое увеличивается объективной и проекционной электронными катушками и фокусируется на люминесцирующий экран или фотопластину. Обнаруженные на экране вирионы фотографируют и изучают по фотографии. Это связано с тем, что под действием электронов препарат быстро выгорает и изображение сохраняется всего несколько минут.

В качестве препаратов для электронной микроскопии используют вируссодержащую суспензию или ультратонкие (40-60 нм) гистосрезы тканей. При подготовке суспензии значение имеет концентрация вируса в материале и контаминация балластными веществами. Поэтому вирусную суспензию часто концентрируют ультрацентрифугированием и очищают фильтрацией. Препараты размещают на металлических опорных сетках, имеющих форму дисков диаметром 3 мм. В 1 мм2 сетки находится 100 ячеек, одна ячейка одно поле зрения микроскопа. Сетки предварительно покрывают тонкой пленкой из колодия или формавара, чтобы препарат не проваливался сквозь сетку.

Биологические объекты обладают слабой электронно-оптической плотностью, поэтому на экране проецируется размытое изображение. Для четкости изображения препараты перед микрокопированием подвергаются контрастированию веществами, содержащими атомы тяжелых металлов (хром, свинец, осмий, вольфрам, платина, золото и др.). Для этого применяют 1-2 %-ные водные растворы фосфорно-вольфрамовой, фосфорно-молибденовой, осмиевой кислот, растворы уранилацетата или уксуснокислого свинца. Различают позитивное и негативное контрастирование.

При негативном контрастировании раствор контрастного вещества наносится на сетку с препаратом на 15-40 секунд, избыток удаляется. Затем препарат подсушивают и микроскопируют. Более плотное контрастное вещество окружает объект (вирус) с меньшей плотностью и он хорошо виден на темном фоне.

При позитивном контрастировании контакт препарата с раствором контрастирующего вещества составляет от нескольких минут до нескольких часов, избыток которого затем удаляется промыванием дистиллированной водой. Атомы тяжелых металлов соединяясь со структурами объекта (вируса) увеличивают его оптическую плотность и он хорошо видим на светлом фоне.

С помощью электронной микроскопии идентифицировать вирус можно только до уровня семейства, но не вида, так как все вирусы, входящие в одно семейство имеют сходное строение. Для определения вида вируса используют метод иммунно-электронной микроскопии, который основан взаимодействии вирионов вируса со специфическими антителами. В результате этой реакции образуются комплексы вируса и антител в виде агрегатов, хорошо видимых под микроскопом.

 Далее преподаватель знакомит студентов с устройством и внешним видом, электронного микроскопа, расположенным в межкафедральной лаборатории УГАВМ (опорная сетка, капсулы для сетки, нож ультрамикротома), демонстрирует фотографии вирусов сделанные на электронном микроскопе.

 

3 Окрашивание мазков - препаратов методом по Морозову для диагностики оспы кур

Метод серебрения по Морозову основан на способности вирусных частиц после разрыхления их оболочки адсорбировать частицы серебра. В результате чего, размеры вирионов увеличиваются на столько, что их можно увидеть в световой микроскоп. Особенность этого метода состоит в том, что он применим только для окрашивания вируса оспы.

Задание. Окрасить препарат из вакцинного штамма оспы кур методом серебрения по Морозову.

Этапы выполнения задания

1 Подготовить оборудование: набор реактивов для окраски по Морозову, дистиллированная вода, препарат–мазок из оспенного материала, фильтровальная бумага, пинцет, спиртовка.

2 Окрасить по методу Морозова препарата–мазок из оспенного материала.

2.1 На препарат нанести реактив № 1 (жидкость Руге) на 1 минуту для фиксирования.

2.2 Препарат промыть водой и нанести реактив № 2 (протравитель) на 1-2 минуты подогревая до отхождения паров.

2.3 Препарат промыть водой и нанести реактив № 3 (краситель- раствор аммиачного серебра) на 2-3 минуты, подогревая до появления коричневого окрашивания.

2.4 Препарат промыть водой, просушить.

3 Просмотреть под микроскопом на увеличении 90 и микрокартину зарисовать в тетрадь.

 

                                  Вопросы и задания для контроля знаний

1 С какой целью применяется световая микроскопия в вирусологии?

2 Что такое вирусные тельца-включение и как они образуются?

3 Что означает понятие — вирусоскопия и для чего она применяется?

 4 Опишите принципы работы электронного микроскопа.

5 Как готовят препарат для электронной микроскопии

6 Что такое позитивное контрастирование?

 

 ТЕМА6 «МЕТОДЫ ТИТРОВАНИЯ ВИРУСОВ»

Цель - формирование знаний о способах титрования вирусов и навыков титрования вирусов по гемагглютинирующей активности.

 

                              Материальное обеспечение

 Пипетки на 1-2 мл, полистероловые панели с луночками, резиновые груши, вируссодержащая суспензия (аллантоисная жидкость зараженных куриных эмбрионов), пробирки с 1 %-ной взвесью эритроцитов кур, 0, 9 % раствор хлорида натрия, сосуд с дезинфицирующей жидкостью, таблицы, схема постановки РГА.

                         План

1 Титр вируса.

2 Титрование вируса по гемагглютинирующей активности.

3 Титрование вирусов по инфекционному действию.

 

Титр вируса

В ветеринарной практике при заражении живых объектов постоянно возникает необходимость определения количества вирусов в том или ином материале. Это необходимо:

— при экспериментальном заражении вирусами живых лабораторных систем;

— в производстве противовирусных вакцин и диагностических препаратов;

— при оценке активности вакцинных и диагностических препаратов;

— для постановки серологических реакций при диагностике вирусных болезней

Содержание вируса, в каком либо материале определяют по титру вируса в нём.

За титр вируса принимают такое его количество, которое находится в единице объема материала. Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых единицах (объём, масса и т. п.), титр вируса определяют косвенно -по его воздействию на другие объекты.

Существуют 2 способа титрования вирусов. Первый основан на гемагглютинирующей активности вируса т.е. способности вирусов агглютинировать эритроциты. В этом случае титр вируса выражают в единицах активности. Второй способ основан на инфекционном действии вируса на живую систему, т.е. способности вирусов вызывать инфекционный процесс в зараженных живых объектах (лабораторные животные, куриные эмбрионы, клеточные культуры) и поэтому титр вируса выражают в единицах действия.

 

⇐ Предыдущая123456Следующая ⇒

Поделиться: