Титрование вируса по гемагглютинирующей активности

Этот способ применяют для титрования вирусов, способных склеивать (агглютинировать) эритроциты. Для этого используют реакцию гемагглютинации (РГА) и титр выражают в количестве гемагглютинирующих единиц /ГАЕ/, содержащихся в одном миллилитре вируссодержащего материала. РГА возможна благодаря наличию комплиментарных рецепторов у вирусов и у эритроцитов. У вирусов, такими рецепторами являются поверхностные V-антигены (гемагглютинины), а у эритроцитов это мукопротеиновые выступы, содержащие нейраминовую кислоту.

Реакция проходит в 3 фазы:

1 Адсорбция вирусов на эритроцитах.

2 Склеивание эритроцитов и образование осадка (агглютината).

3 Рассыпание агглютината. Эта фаза наблюдается лишь у вирусов имеющих фермент нейраминидазу, который разрушает нейраминовую кислоту рецепторов эритроцитов.

Компоненты реакции:

1 Вируссодержащий материал в виде тканевой суспензии 1: 10, эмбриональная или культуральная жидкость.

2 1 % взвесь отмытых эритроцитов кур на физиологическом растворе.

3 Физиологический раствор (0, 9 % раствор хлорида натрия).

Порядок постановки РГА.

Из вируссодержащего материала готовят двукратные разведения (от 1: 2 до 1: 512 и выше) на физиологическом растворе в луночках полистероловых панелей.

К каждому разведению добавляют равный бьем 1 % взвеси эритроцитов.

Панель встряхивают и выдерживают про комнатной температуре 30-40 мин.

Учёт реакции проводят по наличию и степени агглютинации эритроцитов.

Степень агглютинации эритроцитов выражается в крестах:

1 +++ — осадок мелко-зернистый в виде перевернутого зонтика.

2 ++ — осадок в виде зонтика, на дне лунки небольшой диск из неагглютинированных эритроцитов

3 + — осадок виде диска, по краю которого небольшой «зонтик» из агглютинированных эритроцитов

4 – эритроциты в виде крупного диска с ровными краями на дне лунки.

За титр вируса принимают наибольшее разведение вируссодержащего материала, вызывающего агглютинацию эритроцитов в 2-3 креста, что составляет одну гемагглютинирующую единицу (ГАЕ)

Для вирусов, не обладающих гемагглютинирующей активностью, применяют другой способ титрования.

 

3 Титрование вирусов по инфекционному действию

Этот способ титрования можно осуществить двумя методами:

Первый метод основан на обнаружении единичного эффекта действия вируса. В этом случае титр оценивается в единицах действия. Так при заражении К. Э вирусом оспы на ХАО образуются отдельные очаги (фокусы) поражения – оспинки. Считается, что каждая оспинка — результат репродукции одной вирусной частицы в клетках ХАО. Она принимается за одну единицу действия — оспообразующую единицу (1 00Е)

При культивировании вирусов по методу Дюльбекко в клеточной культуре под агаровым слоем с индикатором, появляются островки мёртвых клеток (неокрашенные пятна), которые называются бляшки. Одна бляшка также считается результатом репродукции одной вирусной частицы и принимается за одну единицу действия –бляшкообразующую единицу (1 БОЕ)

И соответственно, сколько обнаружено оспинок на ХАО куриного эмбриона или бляшек в матрасе с культурой клеток, такое количество вирионов содержится в заражающей дозе вируссодержащей суспензии.

Титр вируса в исходной суспензии определяется по формуле:

Где:

 Т – количество едениц действвия (БОЕ или ООЕ) в 1 мл вирусной суспензии 

n- среднее арифметическое количество бляшек на один матрас или оспинок на 1 куриный эмбрион

v- объем заражающей дозы

a- разведение вируссодержащего материала, взятого для заражения

Этот метод титрования применим только для оспо- или бляшкообразующих вирусов.

У остальных вирусов титр определяют вторым методом- по эффекту инфекционного действия на заражаемый живой объект. В этом случае титр вируса выражают количеством средних эффективных доз (ЭД 50) содержащихся в 1 мл вирусной суспензии. Одна средняя эффективная доза это такая доза вируса, которая вызывает эффект инфекционного действия у 50 % зараженных живых объектов. В зависимости от того на какой живой системе проводят титрование, средняя эффективная доза может быть не одинаковой и выражаться по — разному.

Так если титрование проводят на лабораторных животных, ЭД 50 может называться:

ЛД50 – средняя летальная доза. 1ЛД 50 – это доза вируса вызывающая гибель 50 % зараженных лабораторных животных;

ИД 50 — средняя инфекционная доза. 1ЛД 50 – доза вируса вызывающая клинические и патоморфологические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных.

Если титрование проводят на куриных эмбрионах, ЭД 50 будет называться:

ЭЛД 50 – средняя эмбриональная летальная доза.1ЭЛД 50 -доза вируса вызывающая гибель 50 % зараженных куриных эмбрионов

ЭИД 50 – средняя эмбриональная инфекционная доза.1ЭИД 50 – это доза вируса вызывающая патологические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов.

Если титрование проводится на культуре клеток то, средняя эффективная доза выражается как средняя цитопатическая доза (ЦПД 50).1ЦПД 50 – доза вируса вызывающая цитопатическое действие в 50 % пробирочных культурой клеток.

Титрование вирусов по среднему эффективному действию универсально и подходит для любого вируса. Однако оно трудоёмкое, длительное и требует математических расчётов.

 При этом методе титрования сначала готовят ряд последовательных десятикратных разведений исследуемой вирусной суспензии. Десятикратные разведения вируса берут по причине того, что величина инфекционного эффекта вируса пропорциональна логарифму его дозы (или разведению). Кроме того, при десятикратном разведении легче делать обсчёт. Одинаковым объемом каждого из разведений заражают не менее 4-6 тест-объектов (лабораторных животных, куриных эмбрионов или пробирок с культурой клеток).

После определённого времени, которое зависит от вида вируса, учитывают результат действия вируса на живой объект (гибель или заболевание, патоморфологические изменения или ЦПД).

Находят то разведение вируса, при котором у 50 % тест-объектов вирус проявил свое инфекционное действие и считают, что в нём находится 1ЭД 50. В том же объёме исходного материала будет столько ЭД 50, во сколько раз разведена вируссодержащая суспензия. Затем ведут пересчёт в единице объема -1мл. Это и будет титр вируса в данном материале.

Однако при определении титра этим методом, редко можно определить точное разведение вируса, в котором 1 ЭД50, так как количество, например, живых и павших животных часто не совпадает. В этом случае прибегают к математической обработке данных по методу Рида и Менча или Кербера или других авторов.

Задание 1. Провести титрование вируссодержащей суспензии в РГА. 

Этапы выполнения задания

1 Подготовить оборудование: полистероловая панель, вирусный материал полученный на занятии «Индикация вирусов в зараженных куриных эмбрионах», две пипетки, груша, пробирка с физ. раствором, пробирка с 1% взвесью эритроцитов курицы

2 Провести титрование вируссодержащей суспензии в РГА по предложенной схеме.

Схема РГА:

— в 1ряд лунок полистероловых панелей внести пипеткой по 0, 2 мл физ. раствора.

— в 1 лунку ряда пипеткой внести 0, 2 мл вируссодержащей суспензии (аллантоисной жидкости зараженного куриного эмбриона).

— приготовить двукратные разведения вируссодержащей суспензии путём переноса из 1 лунки 0, 2 мл во вторую, затем в третью и т д. из 10 лунки 0, 2 мл вылить в дез раствор; две последние лунки оставить для контроля эритроцитов.

— во все лунки ряда внести по 0, 2 мл 1 % взвеси эритроцитов кур

— панель осторожно встряхнуть и оставить при комнатной температуре на 30 мин.

Провести учёт реакции и рассчитать титр вируса в РГА.

Задание 2. Решить две задачи на титрование вирусов.

Задача № 1

Пять куриных эмбрионов заразили вируссодержащей суспензией в разведении 10  по 0, 2 мл. При учёте результатов заражения оказалось, что количество оспенных очагов в эмбрионах составило: в первом-10; во втором-13; в третьем- 6; в четвертом-9; в пятом-10. Рассчитать титр вируса в исходной вируссодержащей суспензии.

Задача № 2.

Из вируссодержащего материала приготовлено 6 разведений 10 ; 10 ; 10 ; 10 ; 10 ; 10

Каждым из разведений в объеме по 0, 2 мл заразили по 6 белых мышей. В результате были получены следующие данные.

Разведение вируссодержащего материала	Количество зараженных животных	Из них осталось
		живых	пало
-1 10	6	0	6
-2 10	6	1	5
-3 10	6	2	4
-4 10	6	3	3
-5 10	6	4	2
-6 10	6	6	0

 

Рассчитать титр вируса в исходном вируссодержащем материале.

Вопросы и задания для контроля знаний

1 Что такое титр вируса? Для чего он нужен в вирусологии?

2 Какими способами определяют титр вируса?

3 В чём суть определения титра по гемагглютинирующей активности?

4 В чём принцип определения титра вируса по инфекционному действию?

5 Опишите методику постановки РГА.

6 Опишите методику титрования по инфекционному действию.

7 Что применяют в качестве тест объекта при тировании по инфекционному действию?

 

  ТЕМА 7 «ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ. РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ (РН)»

Цель- закрепление  знаний об использовании в вирусологии серологических реакций и формирование теоретических навыков постановки реакции нейтрализации.

 

                                         Материальное обеспечение

Схемы результатов РН разных вариантов постановки, культуры клеток нормальные и с ЦПД, плакат по ЦПД, музейные препараты с готовыми результатами РН, микроскопы.

                                           План

1 Серологические реакции, применяемые в вирусологии.

2 Реакция нейтрализации (РН).

 

 

1 Серологические реакции, применяемые в вирусологии

Все серологические реакции основаны на взаимодействии антигена с антителом. В вирусологии это взаимодействие вирусного антигена и противовирусных (специфических) антител.

В вирусологии серологические реакции применяются во всех направлениях диагностических исследований:

— для обнаружения вирусных антигенов при исследовании патологического материала

— для идентификации выделенного вируса

— в ретроспективной диагностике вирусных инфекций

Любая серологическая реакция основана на взаимодействии антигена с антителами. В вирусологии антигеном являются вирусные белки, а антителами иммуноглобулины сыворотки крови илми других биологических жидкостей, выработанные иммунными клетками организма на эти вирусные белки. Образованный в результате реакции комплекс антиген-антитело в большинстве не видим невооруженным глазом из-за малых размеров компонентов реакции. Поэтому для выявления взаимодействия антигена с антителом используют разные методы:

1 свойство вирусов агглютинировать эритроциты (РТГА)

2 маркировка одного из компонентов реакции (РНГА, ИФА, МФА)

3 использование индикаторной системы (РСК, РН)

Реакция нейтрализации, применяемая в вирусологии, является высокоспецифичной универсальной серологической реакцией. Несмотря на ее недостатки: трудоемкость, соблюдение стерильности при постановке, длительность биопробы и высокая стоимость живых тест-систем, эта реакция служит эталоном при оценке всех других серологических реакций и позволяет:

1   идентифицировать вирусы;

2   проводить типизацию вируса;

3   титровать вирусы и антитела к ним;

4   изучать антигенную структуру вирусов.

 

2 Реакция нейтрализации (РН)

Реакция нейтрализации это серологическая реакция основанная на взаимодействии вирусного антигена со специвфическими антителами в результате кторого происходит нейтрализация инфекционного действия вируса..

Чтобы установить факт нейтрализации инфекционности, смесью вируса с сывороткой заражают чувствительные к данному вирусу живые системы (тест-объект). Результат оценивают по наличию или отсутствию инфекционного действия вируса на живую систему, а именно, гибель или патоморфологические изменения у зараженных лабораторных животных или куриных эмбрионов или цитопатическое действие в культурах клеток.

Нейтрализующие действие сыворотки зависит от концентрации антител в ней и количества вируса в вирусной суспензии, поэтому реакцию нейтрализации в зависимости от задачи можно ставить в двух вариантах:

1 вариант с постоянной дозой вируса и разными разведениями сыворотки;

2 вариант с постоянными разведениями сыворотки и разными дозам вируса.

Реакцию нейтрализации в первом варианте используют для обнаружения и определения титра вируснейтрализующих антител в сыворотках крови.

С этой целью исследуемую сыворотку перед постановкой реакции освобождают от термолабильных вирусных ингибиторов прогреванием 30 минут при 5 6° С или другими методами. А затем готовят двукратные разведения сыворотки.

Каждое разведение смешивают с равным объемом вирусной суспензии содержащим 100 ЭД50. Смесь выдерживают при температуре 4, 22 или 37 С от 30 минут до 18 часов в зависимости от биологических свойств вируса.

Каждым разведением заражают не менее 4-х тест-объектов (лабораторных животных, куриных эмбрионов или пробирочные культуры клеток).

Через определенное время проводят учет реакции по наличию инфекционного действия вируса на живые объекты. Начинают учет с контролей (смотри схему).

 

Схема результатов РН по 1 варианту постановки

Разведения сыв-ки   компоненты	1: 4	1: 8	1: 16	1: 32	1: 64	1: 128
Сыворотка испытуемая+ вирус (100 ЭД50)+физ. раствор	_ _ _ _	_ _ _ _	_ _ _ _	_ _ + +	+ + + +	+ + + +
Раствор для разведения сыворотки: физ. раствор (контроль)	_ _ _ _
Сыворотка исследуемая+физ. раствор (контроль)	_ _ _ _
Вирус 100 ЭД50+ физ. раствор (контроль)	+ + + +

                  

Примечание: + — наличие патогенного действия на зараженный тест — объект

— отсутствие патогенного действия на зараженный тест-объект

За титр антител в сыворотке крови принимают наибольшее ее разведение, предохраняющее от инфекционного действия вируса 50 % живых объектов

Второй вариант постановки РН используется чаще при идентификации неизвестного вируса. Для этого используют специфическую сыворотку и нормальную сыворотку в отношении определенного вируса, предварительно освобожденные от вирусных ингибиторов, в разведении 1: 10.

Готовят два ряда 10- кратных разведений исследуемого вируса в одинаковых объемах. Последнее разведение должно превышать титр вируса.

Каждое разведение первого ряда смешивают с равным объемом специфической сыворотки, содержащей антитела к определенному вирусу (например к вирусу бешенства) и каждое разведение вируса второго ряда смешивают с равным объемом нормальной сыворотки, не содержащей антител к данному вирусу. Смеси выдерживают определенное время, аналогично 1 варианту и заражают не менее 4-х тест — объектов на каждую смесь.

Через определенное время проводят учет реакции по наличию инфекционного действия вируса на живые объекты, начиная с контролей. Определяют титр вируса в присутствии нормальной и специфической сывороток.. За титр вируса принимают наибольшее разведение вирусной суспензии еще вызывающее инфекционное действие у 50 % зараженных живых объектов.

Схема результатов РН по 2 варианту

Разведения сыв-ки   компоненты	10	10	10	10	10	10
Сыворотка специфическая+вирус исследуемый	+ + + +	+ + + +	+ + _ _	_ _ _ _	_ _ _ _	_ _ _ _
Сыворотка нормальная+ вирус исследуемый	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + _	+ + _ _	_ _ _ _
Сыворотки (контроль) 1) специфическая+физ. раствор 2) нормальная+физ. раствор	_ _ _ _
Вирус исследуемый+ физ. раствор (контроль)	+ + + +

 

Примечание: + наличие патогенного действия на тест-объект

— отсутствие патогенного действия на тест-объект.

После расчета титров, определяют индекс нейтрализации (IN), который равен отношению титра вируса, в присутствии нормальной сыворотки (Т

) к титру вируса в присутствии специфической сыворотки (Т ).

В нашем примере:

IN= = = 10 =100

Индекс нейтрализации показывает во сколько раз специфическая сыворотка снижает титр вируса по сравнению с нормальной. ИН до 10 указывает на отрицательный результат РН. Это значит, что антитела специфической сыворотки не гомологичны данному вирусу. ИН от 11 до 50 расценивается как сомнительный результат РН. ИН выше 50- положительный результат. Это говорит о гомологичности антител специфической сыворотки исследуемому вирусу и означает, что это тот вирус, к которому взята специфическая сыворотка в РН.

Преимущества реакции нейтрализации:

1) универсальность;

2) высокая специфичность.

Недостатки:

1) трудоемкость;

2) стерильность;

3) высокая стоимость тест –объектов;

4) длительность биопробы.

Несмотря на существенные недостатки реакция является эталоном для всех других серологических реакций.

Задание. Провести учет реакции нейтрализации на культуре клеток

Этапы выполнениязадания

1 Вспомнить методы индикации размножения вирусов на культуре клеток по ЦПД.

2 Подготовить оборудование (микроскоп, музейный препарат).

3 Провести учет РН по ЦПД -определить титр антител в исследуемой сыворотке крови к данному вирусу в музейном препарате.

                                     Вопросы и задания для контроля знаний

1 На чем основаны серологические реакции?

2 Какие серологические реакции применяются в вирусологии?

3 Раскройте суть реакции нейтрализации.

4 В чем состоят преимущества и недостатки РН?

5 Для чего в вирусологии применяется РН?

6 Что применяют в качестве тест объекта при РН?

 

 

ТЕМА 8 «РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РТГА) И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ»

Цель - формирование навыков постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА)
                                 Материальное обеспечение

Вируссодержащая суспензия (вакцинный штамм вируса ньюкаслской болезни птиц) титре 4 ГАЕ/мл, специфическая сыворотка крови кур (с антителами против данного вируса), нормальная (отрицательная) сыворотка крови кур, исследуемые сыворотки крови, 1 % взвесь эритроцитов кур, физиологический раствор, пипетки на 1, 2 мл, полистероловые панели с луночками, емкости с дез. раствором.
                                  План
1 Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)и ее применение.

2 Техника постановки РТГА.

1 Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) и ее применение

Одной из серологических реакций, широко применяемой в вирусологических лабораториях является реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Впервые РТГА была предложена в США Херстом в1941 году для диагностики гриппа.

РТГА основана как все серологические реакции на взаимодействии вирусного антигена со специфическими антителами сыворотки крови. И способности вируса к гемагглютинации. При взаимодействии с вирусными белками (антигеном) специфические антитела блокируют рецепторы вирусов ответственные за агглютинацию эритроцитов (гемагглютинины), и вирус утрачивает способность склеивать эритроциты.

По наличию и ли отсутствию агглютинации вирусом эритроцитов судят об отсутвию или наличию специфических антител к нему в исследуемой сыворотке крови Для этого сначала смешивают сыворотку крови и суспензию вируса. После определённого времени к смеси вирус + сыворотка добавляют суспензию эритроцитов, которые вирус агглютинирует.

В вирусологии РТГА применяют:

1 для обнаружения антител в сыворотке крови к определённому вирусу и определение их титра с целью установления наличия и напряжённости постинфекционного и поствакционального иммунитета, а также с целью ретроспективной диагностики вирусных инфекций.

2 для идентификации выделенных штаммов вирусов и определения их антигенного родства с эталонными штаммами.

 

2 Техника проведения РТГА

Проведение РТГА состоит из трех этапов.

Подготовительный этап  включает:

— приготовление 1 % взвеси эритроцитов. В РТГА используют только тот вид эритроцитов, с которыми вирус даёт постоянные результаты (агглютинирует их). Для этого свежеполученную кровь дефибринируют в колбе со стеклянными бусами или смешивают с антикоагулянтом. Кровь центрифугируют при 1, 5-2 тыс., оборотах в минуту. Надосадочную жидкость (плазма крови) сливают. Осадок эритроцитов заливают физ. раствором и ресуспензируют. Центрифугируют при том же режиме. Так отмывают эритроциты 2-3 раза. Из полученных отмытых эритроцитов готовят 1 % взвесь на 0, 9 %растворе NaCl.

— подготовка сывороток крови (удаление нецифических ингибиторов вируса). С этой целью применяют следующие методы:

а) физический: метод осаждения углекислым газом, адсорбция каолином, нагревание.

б) химический: окисление перйодатом калия.

Наиболее часто применяют прогревание сыворотки на водяной бане при температуре 56-62 C 30 минут и разводят 1: 5 для снижения концентрации оставшихс вирусных ингибиторов.

— приготовление рабочего разведения антигена. В РТГА активность вирусной суспензии должна составлять 4 ГАЕ в дозе вируса. Поэтому в суспензии сначала определяют титр вируса, а затем разводят физиологическим раствором до получения 4 ГАЕ в дозе. Проверяют правильность приготовления рабочего разведения в РГА.

 

Схема контрольного титрования рабочего разведения вируса

Компоненты	2ГАЕ	1ГАЕ	0, 5ГАЕ	0, 25ГАЕ
Изотонический раствор, мл	0, 2	0, 2	0, 2	0, 2
Вирусная суспензия 4ГАЕ	0, 2	Перенос по 0, 2 мл		Из лунки 0, 2 в дез. раствор
1 %-ная суспензия эритроцитов, мл	0, 2	0, 2	0, 2	0, 2
	Инкубация при комнатной температуре
Результат	+++	+++	-	-

 

При правильном выборе рабочей разведения вируса в лунках, содержащих вирус в дозе 2 и 1 ГАЕ должна быть чёткая гемагглютинация в остальных, где 0, 5 и 0, 25 ГАЕ гемагглютинации не должно быть.

2 этап -постановка РТГА.

 Реакцию ставят в луночках полистероловых панелей или пробирках.

1 Готовят двукратные разведения исследуемой сыворотки в одинаковых объёмах на физ. растворе.

2 К каждому разведению добавляют равный объём вируссодержащей суспензии в рабочей дозе 4ГАЕ в 1мл.

3 Смесь встряхивают и выдерживают при комнатной температуре 30-60 минут.

4 Во все смеси добавляют 1 % взвесь эритроцитов.

5.Реакцию выдерживают 30-40 мин при комнатной температуре.

Параллельно ставят соответствующие контроли.

3 этап- учёт реакции.

Осуществляется учет реакции по наличию гемагглютинации.

Оценку начинают с контролей.

1 контроль эритроцитов (физ. раствор+эритроциты)– отсутствие гемагглютинации

2 контроль сыворотки (физ. раствор+исследуемая сыворотка+эритроциты) – отсутствие гемагглютинации

3 контроль вируса (физ. раствор+вирус+эритроциты) – 2 и 1 ГАЕ — четкая гемагглютинация 0, 5 и 0, 25 –отсутствие гемагглютинации

4 контроль положительнй реакции (физ. раствор+специфическая(положительная) сыворотка+ вирус +эритроциты)– отсутствие гемагглютинации.

5 контроль отрицательной реакции (физ. раствор+нормальная(отрицательная) сыворотка + вирус + эритроциты) -гемагглютинация +++ или ++крест

После этого проводят учёт реакции с исследуемой сывороткой. Сначала определяют наличие положительного результата реакции, а затем наибольшее разведение сыворотки, которое ещё полностью тормозит гемагглютинацию. Это разведение принимается за титр антител в сыворотке крови к данному вирусу в РТГА.

Преимущество РТГА:

1высокая специфичность;

2 быстрота получения ответа;

3 простота постановки;

4 дешевизна.

Недостатки РТГА:

1 реакция возможна только с гемагглютинирующими вирусами;

2 необходимость получение свежих эритроцитов для реакции каждые 2 недели.

 

Задание. Поставить реакцию торможения гемагглютинации с исследуемой сывороткой.

Этапы выполнения задания

1 Подготовте оборудование: палистероловая панель, пробирка с 0, 9% раствором хлорида натрия (физ. раствор), пробирка с исследуемой сывороткой, пробирка с вирусным антигеном 4ГАЕ, пробирка с 1% взвесью эритроцитов, банка с дез.раствором, 3 пипетки, груша.

2 Проведите реакцию торможения гемагглютинации согласно схеме.

Схема постановки РТГА:
2.1 Во все луночки первого ряда налить 0, 9% раствор хлорида натрия в объеме 0, 2мл, за исключением 6 лунки, куда внести 0, 4 мл.
2.2 В первую лунку и седьмую лунку(контроль сыворотки) внести исследуемую сыворотку в объеме 0, 2 мл. В первой лунке сыворотку пипетировать несколько раз и перенести 0, 2 мл во вторую лунку, снова пипетировать несколько раз и перенести 0, 2 мл в третью и т. д. Из шестой лунки 0, 2 мл вылить в банку с дез. раствором.
2.3 В лунки 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 9 внести антиген по 0, 2 мл (в рабочей дозе 4 ГАЕ). Из девятой лунки перенести 0, 2 мл в лунку 10, из лунки 10 в лунку 11, из лунки 11 в лунку 12, из которой 0, 2 мл вылить в дез раствор.
2.4 Выдержать реакцию 30 мин при комнатной температуре.
2.5Во все лунки внести по 0, 2 мл 1 %-ной взвеси эритроцитов. Реакцию осторожно встряхнуть.
2.6 Выдержать реакцию 30 мин при комнатной температуре.

3. Провести учет результатов реакции и рассчитать титр антител в исследуемой сыворотке крови.

                             Вопросы и задания для контроля знаний

1В чем суть всех серологических реакций и в том числе РТГА?

2 Опишите принцип постановки РТГА.

3 Назовите этапы проведения РТГА и раскройте суть.

4 Как проводят учет РТГА?

5 Где применяют РТГА и в чем ее преимущества и недостатки?

6 Как подбирают эритроциты для РТГА?

 

  ТЕМА9 «РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ»

Цель - Ф ормирование навыков постановки реакции непрямой гемагглютинации.

 

Материальное обеспечение

Исследуемые сыворотки крови, сенсибилизированные эритроциты вирусным антигеном, специфическая ( положительная) и нормальная (отрицательная) сыворотки крови к данному вирусному антигену, макропанели, микропанели, пипетки на 1-2 мл, груша, дез.- раствор.

План

1 Суть реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и ее применение.

2 Техника проведения РНГА.

 

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) и ее применение

Для диагностики инфекций вызываемых вирусами, неспособными агглютинировать эритроциты разработана реакция непрямой гемагглютинации или РНГА, впервые описанная Бернетом и Андерсеном в 1946 году.

РНГА как серологическая реакция основана на взаимодействии вирусных антигенов со специфическими антителами. При этом один из компонентов реакции адсорбирован на эритроцитах, поэтому результат реакции можно увидеть невооруженным глазом в виде осадка склееных (агглютинированны) эритроцитов. В данном случае агглютинация эритроцитов происходит через комплекс антиген- антитело. РНГА является высокоспецифической серологической реакцией и широко применяется в практике при диагностике многих вирусных инфекций.

1 Преимущества РНГА

2 возможность разработки для любых вирусов;

3 высокая специфичность и чувствительность (близка к ИФА);

4 довольно простая методика постановки;

5 быстрота ответа (через 2-3 часа).

Недостатком является сложность в приготовлении сенсибилизированных эритроцитов и сохранение их стабильности.

РНГА применяется в вирусологии в следующих для:

1 Обнаружения антител и определения их титра в сыворотках крови. Для этого используют эритроциты с адсорбированными на них антигенами.

2 Обнаружения и идентификация вирусного антигена. Для этого используют эритроциты, с адсорбированными на них антителами.

 

2 Техника проведения РНГА

1 Подготовительный этап.

 Приготовление сенсибилизированных эритроцитов (эритроцитарный диагностикум) состоит из 4 подэтапов:

1 Получение 10 % взвеси эритроцитов барана. Полученную от барана кровь дефибринируют в колбе со стеклянными бусами, фильтруют через марлевый фильтр, центрифугируют 10 мин при 1, 5-2 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок эритроцитов ресуспендируют в физ. растворе и трёхкратно отмывают с помощью центрифугирования.

2 Фиксация эритроцитов формалином. К 10 %-ной взвеси эритроцитов добавляют такой же объем 5 %-ного раствора формалина на физ. растворе. Смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение суток при 37 С, а затем пятикратно отмывают физ. раствором с рН7, 2 с помощью центрифугирования. Такие эритроциты можно хранить и использовать в течении года. Для этого из них готовят 10 %-ную взвесь на физ. растворе добавляя формалин в соотношении 1: 1000. Перед использованием эритроциты необходимо промыть 2-3 раза физ. раствором.

3 Танизация эритроцитов. Фиксированные эритроциты барана респендируют в физ. растворе до 5 %-ной концентрации и смешивают с равным объёмом раствора танина 1: 2000. Смесь выдерживают при температуре 37 С 10-15 минут, центрифугируют и трёхкратно промывают фосфатно-буферным раствором (рН-7, 2). Установлено что танин дегидрирует эритроциты, снижает электрокинетический потенциал, осмотическую резистентность и понижает проницаемость анионов. В результате их поверхность становится несколько деформированной, сморщенной и зубчатой. Такие эритроциты хорошо адсорбируют различные белки, в том числе вирусные антигены или антитела.

4 Сенсибилизация, т. е. процесс адсорбции антигена или антител на эритроцитах. Взвесь танизированных эритроцитов (10 % на 0, 15 М фосфатном буфере, рН-6, 4) смешивают с равным объёмом очищенного вируса (вирусной суспензии) или очищенных иммуноглобулинов (антител), выдерживают при температуре 37С в течении 1 часа, периодически встряхивая. Далее проводят центрифугирование и отмывание 0, 15 М раствором фосфатного буфера, рН-7, 2. Этот раствор содержит 1 % нормальной кролиной сыворотки (НКС) для стабилизации эритроцитов. На этом же растворе готовят 1 % взвесь сенсибилизированных эритроцитов для РНГА.

 Подготовка сывороток крови

Исследуемые и контрольные сыворотки крови прогревают при 50 С-30 минут и разводят 1: 5 для удаления из них неспецифических ингибиторов.

 

2 этап- постановка РНГА (на примере обнаружения антител к известному вирусу)

Реакция ставится в пробирках и полистероловых панелях макро или микро методом.

1 Готовят двукратное разведение исследуемых сывороток на 0, 9 % растворе NaCI с 1 % нормальной кролиной сыворотки.

2 К каждому разведению добавляют равный объём сенсибилизированных вирусным антигеном эритроцитов.

3 Смесь встряхивают и выдерживают при комнатной температуре 2-3 часа.

Параллельно ставят соответствующие контроли.

4 Учет реакции проводят по наличию агглютинации эритроцитов и оценивают в + (крестах):

+++ агглютинированные эритроциты образуют перевёрнутый зонтик с неровными краями. Реакция положительная.

++ по краю агглютинированных эритроцитов тонкое кольцо из неагглютинированных эритроцитов. Реакция положительная.

+ по краю зонтика широкое кольцо из неагглютинированных эритроцитов. Реакция сомнительная.

— эритроциты в виде диска с ровными краями на дне лунки. Реакция отрицательная

 3 этап- учёт реакции.

Учёт реакции начинают с контролей:

1 Контроль сенсибилизированных эритроцитов (сенсибилизированные эритроциты + физ. раствор) —отсутствие агглютинации эритроцитов.

2 Контроль на отсутствие в исследуемой сыворотке неспецифических гемагглютининов (исследуемая сыворотка + несенсибилизированные (танизированные) эритроциты) –отсутствие агглютинации эритроцитов.

3 Контроль положительный (сенсибилизированные эритроциты + специфическая (положительная) сыворотка) – агглютинация эритроцитов на +++ или ++.

4 Контроль отрицательный (сенсибилизированные эритроциты + нормальная (отрицательная) сыворотка)- отсутствие агглютинации эритроцитов.

После проводят учет реакции с исследуемыми сыворотками. Определяют наличие положительного результата реакции. Затем устанавливают титр антител в РНГА - наибольшее разведение сыворотки, вызывающее агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов.

Задание. Поставить реакцию непрямой гемагглютинации с исследуемой сывороткой.

Этапы выполнения задания

1 Подготовить оборудование: пробирка с исcледуемой сывороткой крови 1: 5, пробирка с 1% взвесью сенсибилизированных эритроцитов вирусным антигеном, пробирка со специфической ( положительной) сывороткой и пробирка с нормальной ( отрицательной) сыворотой к данному вирусному антигену, пробирка с 0, 9 % раствором NaCI, полистироловоя макропанель с луночками, полистироловоя микропанель с луночками 3 пипетки на 1-2 мл, груша, банка с дез.- раствором.

2 Поставить РНГА по схеме:

2.1 В 6 лунок полистероловой макропанели внести по 0, 2 мл 0, 9 % р-ра NaCI.

2.2В первую лунку внести 0, 2 мл исследуемой сыворотки. 1: 5 В первой лунке смесь несколько раз пипетировать и перенести 0, 2мл во вторую лунку. Операцию повторить и перенести 0, 2 мл в третью и так далее до 6 лунки включительно.

2.3 Взять микропанель и перенести по одной капле каждого разведения в соответствующие лунки начиная с меньшего (из 6-ой в 6-ую, из 5-ой в 5-ую и тд.)

В 7 лунку внести каплю физ.раствора чистой пипеткой.

В 8 лунку внести каплю нормальной (отрицательной) сыворотки

 В 9 лунку внести каплю специфической (положительной) сыворотки

2.4 Во все лунки чистой пипеткой внести по одной капле сенсибилизированных эритроцитов.

2.5 Плашку аккуратно встряхнуть и оставить на 1 час при комнатной температуре.

3 Провести учёт реакции начиная с контролей и определить титр антител в исследуемой сыворотке крови.

 

Вопросы и задания для контроля знаний

⇐ Предыдущая123456Следующая ⇒

Поделиться: