Люминесцентный микроскоп и его применение в вирусологии

В вирусологических исследованиях часто используют люминесцентный микроскоп, работа которого основана на явлении люминесценции. Сущность люминесценции состоит в том, что поглощая различные виды энергии (световую, электрическую), атомы некоторых веществ переходят в возбужденное состояние, а затем возвращаясь в исходное, выделяют поглощенную энергию в виде светового излучения. Люминесценция может быть в виде фосфоресценции, когда свечение объекта продолжается после воздействия, и в виде флуоресценции, когда свечение прекращается сразу после воздействия на объект. Вещества, обладающие интенсивной флуоресценцией, называются флуорохромы. Их широко используют в люминесцентной микроскопии. Люминесцентный микроскоп был создан в 1908 году австрийскими учеными Киллером и Зидентонфом. Принцип действия этого микроскопа состоит в том, что с помощью системы светофильтров выделяется сине-фиолетовая часть спектра, которая направляется на препарат. И если препарат содержит флуорохром, исследователь увидит зеленое или красное свечение в зависимости от вида флуорохрома, так как по правилу Стокса свет флуоресценции имеет большую длину волны, чем поглощенный свет.

В вирусологической практике люминесцентную микроскопию используют в двух методах исследования:

1 Простое флуорохромирование.

2 Метод флуоресцирующих антител (МФА).

2 Простое флуорохромирование

Простое флуорохромирование это обработка исследуемого препарата флуорохромом с целью увеличения силы и контрастности естественного свечения нуклеиновых кислот. Для этого чаще всего применяют флуорохромы акридиновой группы (акридиновый оранжевый).

       Препараты (мазки, мазки-отпечатки, гистосрезы и тд.) фиксируют 96 % этиловым спиртом в течение 15-30 минут и промывают раствором Хенкса. Далее на препарат наносят раствор акридинового оранжевого (1: 10000), через 5-10 мин накрывают покровным стеклом и исследуют под люминесцентным микроскопом. В препарате ДНК светится изумрудно-зеленым, а РНК рубиново красным. Чтобы отличить происхождение нуклеиновых кислот (клеточное или вирусное), препарат пред окрашиванием обрабатывают 0, 5 % раствором ДНК-азы или РНК-азы или облучают УФ-лучами в течение 10 минут. После этого свечение клеточных РНК или ДНК исчезает, а вирусные светятся еще 20-30 мин.

Данный метод позволяет обнаружить вирус в препарате, определить примерно его количество и к какой группе он относиться (ДНК-содержащих или РНК-содержащих вирусов).

3 Метод флуоресцирующих антител (МФА) или реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

Метод флуоресцирующих антител является серологической реакцией, которая основана на взаимодействии вирусного антигена со специфическими антителами, меченными флуорохромом. Поэтому образовавшийся комплекс антиген + антитело-флуорохром обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению флуорохрома.

Антитела получают из сывороток крови животных, гипериммунизированных каким либо вирусным антигеном. Антитела выделяют из сыворотки, концентрируют и связывают с флуорохромом. В качестве флуорохрома используют ФИТЦ ( дает зеленое свечение) или РСХ ( дает красное свечение).

Антитела меченые флуорохромом называют конъюгатом.

Для исследования МФА используют мазки, мазки-отпечатки, гистосрезы из биоматериала или культуры клеток выращенные на покровных стеклах. Препараты фиксируют в охлажденном ацетоне (-10-15 С) от 10 мин до 4 часов в зависимости от вида вируса.

Существует два основных способа постановки МФА: прямой и непрямой.

Прямой способ (Weller, Coons 1954) был разработан для обнаружения вирусных антигенов. Для этого применяют соответствующие каждому антигену флуорисцирующие специфические антитела (конъюгат). Его наносят на препарат и выдерживают в течение 30-60 минут при температуре 37 С во влажной камере. За это время антитела конъюгата связываются с гомологичным вирусным антигеном, если он есть в препарате. Далее препарат отмывают физиологическим раствором от конъюгата, не связавшегося с антигеном, высушивают и исследуют под люминесцентным микроскопом.

Учет реакции осуществляют по наличию и интенсивности флуоресценции исследуемого объекта в крестах:

++++ — яркая сверкающая флуоресценция изумрудно-зеленого цвета

+++ — яркая флуоресценция зеленого цвета

++ — слабая флуоресценция желтовато-зеленого цвета

+ — очень слабая, неопределенного цвета

— — объект не флуоресцирует.

В качестве контроля используют препарат из здоровой ткани, который обрабатывают аналогично исследуемому и одновременно с ним.

Результаты реакции начинают учитывать с контроля, в котором свечения быть не должно. Положительной реакция считается в ++++ или +++.

При непрямом или двухэтапном способе МФА сначала, на 1 этапе, препарат обрабатывают специфичными для исследуемого антигена нефлуоресцирующими антителами. Их наносят на препарат, который затем выдерживают во влажной камере при температуре 37 С 30 -60 минут (первая ступень). В положительном случае образуется комплекс антиген+антитело. На втором этапе препарат отмывают от не связавшихся антител и наносят антивидовой конъюгат, содержащий антивидовые антитела меченные флуорохромом. Антивидовые антитела это антитела против антител (иммуноглобулинов) того вида животного, которому принадлежат антитела, используемые на первомэтапе МФА.

Препарат с антивидовым конъюгатом выдерживают при тех же условиях. В положительном случае антитела конъюгата связываются с антителами, комплекса антиген+антитело.

Учет реакции проводят аналогично прямому способу.

Непрямой способ имеет ряд преимуществ: — может применяться не только для обнаружения антигена, но и для выявления и титрования антител;

— метод требует одного конъюгата для обнаружения любых вирусных антигенов в биоматериале от одного вида животного;

— чувствительность его выше, чем прямого, так как каждая молекула антигена связывает несколько молекул антител, каждое из которых в свою очередь связывает в 2 раза больше молекул антивидовых антител. Это обеспечивает более яркую флуоресценцию и соответственно большую чувствительность, чем при прямом методе.

МФА широко применяется в вирусологии. Его используют для индикации и идентификации многих вирусов. Особенно этот метод ценен для тех вирусов, которые не обладают цитопатогенными, гемагглютинирующими, гемадсорбирующими свойствами. МФА применяется для выявления и титрования противовирусных антител, для изучения: процессов взаимодействия вирусов с клетками, динамики накопления вирусных антигенов в клетке, антигенных связей вирусов, патогенеза вирусных болезней.

К преимуществам МФА можно отнести: экспресность (результат получают в течение 2-3 часов); высокая чувствительность (обнаружение даже малых доз антигена); простота техники постановки.

Основной недостаток МФА это дорогостоещие оборудование и неспецифические реакции, которые могут быть связаны с наличием в конъюгате свободного флуорохрома или неспецифическая сорбция конъюгата на препарате.

МФА входит в состав диагностических наборов на многие вирусные болезни животных и птиц.

 

4 Иммуноферментный анализ(ИФА)

В диагностике вирусных болезней применяются методы, основанные на использовании антител, меченных ферментом. Эта группа методов называется иммуноферментный анализ (ИФА).

Иммуноферментный анализ как серологическая реакция основанная на взаимодействии вирусного антигена со специфическими антителами, меченными ферментом. Поэтому выявление образовавшегося комплекса антиген+антитело-фермент по результату действия фермента.

 ИФА применяется для диагностики всех вирусных болезней животных и птиц, что связано с высокой чувствительностью и специфичностью (не уступает реакции нейтрализации и электронной микроскопии). Основные направления ИФА в вирусологии это ранняя диагностика вирусных болезней (обнаружение вирусных антигенов и антител к ним), исследование уровня постинфекционных или поствакцинальных антител в сыворотках крови и других биологических жидкостях.

Существует два варианта постановки ИФА: гистохимический вариант (иммунопероксидазная реакция) и твердофазный вариант.

Гистохимический вариант ИФА (1966 год Nakane R. K, Pierce G. B.) по методике постановки аналогичен МФА, но отличается тем, что для ИФА используют в качестве конъюгата антитела меченные не флуорохромом, а ферментом (пероксидаза или щелочная фосфотаза). Учет реакции проводят под световым микроскопом.

Из биоматериала (кровь, лимфа, носоглоточные смывы, органы и ткани) готовят мазки, мазки-отпечатки, гистосрезы. Все препараты фиксируют в охлажденном ацетоне (-10-20 С) в течение 10 минут и высушивают на воздухе.

Данный вариант можно ставить также двумя способами — прямым и непрямым как и МФА. На фиксированный препарат наносят конъюгат – ферментмеченные антитела к определенному вирусному антигену при прямом методе или сначала препарат обрабатывают антителами гомологичными исследуемому вирусному антигену, а затем наносят антивидовидовой конъюгат (ферментмеченые антивидовые антитела) при непрямом методе. После отмывания, от несвязавшегося конъюгата на препарат наносят субстрат, бесцветный раствор вещества, которое под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт. Он окрашивает препарат, что хорошо видно в световой микроскоп. При этом в препарате видны гранулы коричневого цвета или диффузное коричнево-желтое окрашивание. В контрольных препаратах окрашивания быть не должно. Гистохимический вариант ИФА используют в основном для обнаружения вирусных антигенов в биоматериале.

Твердофазный ИФА (1971 год Engall E, Parlmann P.) основан на обнаружении антигенов или антител фиксированных на нерастворимом носителе (твердая фаза). В качестве нерастворимых носителей могут быть стеклянные или нейлоновые шарики, полистероловые или керамические пробирки и микропанели, нитроцеллюлозные фильтры. Материалы, из которых изготовлены носители, хорошо адсорбируют на себе белки и прочно их удерживают. В последнее время широко используют полистероловые микропанели.

В качестве исследуемого материала используют любые биологические жидкости, в которых выявляют вирусные антигены или противовирусные антитела.

     Для обнаружения вирусного антигена в лунки микропанелей сорбируют антитела к исследуемому вирусному антигену, а именно раствором специфических антител заполняют лунки микропанелей и выдерживают при 37 С 1 час или при 4 С 12 часов. Затем раствор удаляют, а лунки отмывают от не связавшихся с полистеролом антител. В лунки вносят исследуемый материал и контрольные положительный и отрицательный антигены. Микропанели выдерживают 30 мин- 1 час при 37 С и отмывают от антигена, не связавшегося с сорбированными антителами. Образовавшийся комплекс антитело-антиген выявляют добавлением раствора конъюгата — ферментмеченными антителами к исследуемому вирусному антигену. Микропанели опять выдерживают при 37 С 30 мин- 1 час. За это время антитела конъюгат присоединяется к вирусному антигену. Для выявления связанного конъюгата с комплексом антитело-антиген, после промывания, в лунки добавляют раствор субстрата, который под действием фермента из бесцветного становиться окрашенным.

Учет реакции проводят по разности окраски опытных образцов с отрицательным контролем визуально или колориметрическим способом на автоматических считывающих устройствах. При этом отрицательный контроль либо совсем не окрашен, либо окрашен слабо. За положительный результат принимают превышение оптической плотности опытных образцов над отрицательным контролем в 5-10 раз

Для обнаружения противовирусных антител в исследуемых сыворотках используют микропанели в лунках, которых сорбирован очищенный вирусный антиген. В лунки микропанелей последовательно вносят исследуемые и контрольные (положительную и отрицательную) сыворотки, и выдерживают при 37 С 30 мин- 1 час. При наличии в сыворотке антител, гомологичных сорбированному антигену, образуется комплекс антиген+антитело. Для выявления этого комплекса после отмывания лунок от несвязавшихся антител вносят антивидовой конъюгат (ферментмеченные антивидовые антитела) и выдерживают при 37 С 30 мин-1 час. После промывания в лунки вносят раствор субстрата. Учет реакции осуществляют аналогично реакции обнаружения антигена.

 

Задание. Провести учет результатов ИФА.

Этапы выполнения задания

     1 Посмотреть фильм по ИФА;

     2 зарисовать схему постановки твердофазного ИФА для обнаружения антител;

3. определить титр антител в исследуемой сыворотке крови на готовом результате твердофазного ИФА.

                              Вопросы и задания для контроля знаний

1Для чего используют люминесцентный микроскоп в вирусологии?

2 В чем заключается метод простого флуорохромирования?

3 Как дефференцируют ДНК и РНК содержащие вирусы?

4 В чем состоит суть МФА и его использование в вирусологии?

5 Какие модификации МФА применяются?

6 Какие достоинства и недостатки МФА?

7 В чем принцип ИФА и его использование в диагностике вирусных болезней?

8 Опишите алгоритм учета результата ИФА.

9 Какие ферменты используют для конъюгата?

 

 

  ТЕМА12 «МЕТОД ДНК-ЗОНДОВ, ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ»

Цель- формирование теоретических навыков проведения метода ДНК-зондов и полимеразной цепной реакции.

 

                              Материальное обеспечение

Таблицы со схемой метода ДНК-зондов и ПЦР, полистероловые плашки, нитроцеллюлозные фильтры, дозаторы, диагностический набор реактивов для постановки ПЦР на грипп птиц, фильм «ПЦР», мультимедийное оборудование.

                                     План

1 Методы генодиагностики.

2 Метод ДНК-зондов.

3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

 

1 Методы генодиагностики

На современном этапе развития вирусологии актуальным является поиск новых методов диагностики вирусных инфекций, которые сочетали бы высокую чувствительность и специфичность с доступностью постановки в практических лабораториях.

В последнеевремя разработаны методы диагностики, которые можно объединить понятием генодиагностика — это комплекс методов, которые позволяют обнаруживать гены или участки нуклеиновых кислот, специфичные для определенного вида возбудителя инфекционной болезни, в том числе и вирусной этиологии. Становление генодиагностики началось в 1953 году, когда Уотсон и Крик раскрыли структуру ДНК.

Первым методом генодиагностики была основанная на принципе комплементарности реакция гибридизации ДНК с ДНК, разработанная в конце 70-х годов или метод ДНК-зондов.

Метод ДНК-зондов

Метод ДНК-зондов был разработан в конце 70-ых годов. Его суть состоит в обнаружении ДНК вируса в любом материале с помощью ДНК-зонда, который присоединяется к комплементарному участку ДНК, образуя гибрид. Выявляют этот гибрид по действию метки зонда.

 Получение ДНК-зондов.

ДНК-зонд — это одноцепочный фрагмент специфического участка ДНК исследуемого возбудителя, полученный клонированием в кишечной палочке и соединенный с меткой (фермент, радиоактивный изотоп – I³², биотин).

 Подготовка материала к исследованию.

1. Из исследуемого материала готовят 10% вируссодержащую суспензию по общепринятой методике.

2. К суспензии добавляют раствор, содержащий фермент протеиназу и выдерживают при 37°С от 40 мин до 2-х часов. Протеиназа разрушает весь белок суспензии. Затем материал освобождают от фермента, проводя депротеинизацию фенолом или хлороформом.

3После полного удаления всех белков нуклеиновую кислоту осаждают при -70 С, отмывают спиртом, переводят в раствор и таким образом получают очищенную нуклеиновую кислоту исследуемого вирусаи

4 Образец нуклеиновой кислоты подвергают денатурации путем кипячения или обработкой щелочью при нагревании, получая нуклеиновую кислоту в одноцепочной форме. менно в таком виде она используется для реакции.                               

Проведение реакции гибридизации выделенных вирусных нуклеиновых кислот с ДНК-зондами.

Для этого фильтры, пропитанные выделенной нуклеиновой кислотой из исследуемой пробы, помещают в раствор ДНК-зондов в рабочем разведении. Выдерживают от 2 до 16 часов при температуре 55-65°С. При этом происходит присоединение ДНК-зондов к комплементарным участкам денатурированной одноцепочной ДНК, если они есть, образуя гибрид Затем пробы трехкратно отмывают от лишних (не связавшихся) зондов.

Выявление гибридов ДНК с ДНК-зондами, оставшихся на фильтре (учет результатов реакции) зависит от использованной метки зонда. Так, если метка радиоактивная, то проводят учет в сцинтилляционном счетчике или при помощи метода радиоавтографии на рентгеновской пленке, если это фермент, то добавлением субстрата меняющего окраску под действием фермента, если это биотин — то с помощью конъюгата стреаптавидина с щелочной фосфатазой (фермента) и субстрата. Полное время анализа составляет одни сутки.

Этот метод является высокочувствительным и высокоспецифичным.С его помощью можно обнаружить до 1 нг очищенной ДНК, что соответствует 5х10⁵ вирусных частиц или 1 ГАЕ. Этим методом можно выявить связанные вирусные частицы, которые не выявляются другими методами. Используя его можно выявить вирусоносителей, опасных в эпизоотическом плане.

На основе метода ДНК-зондов разработаны тест-системы для выявления аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, инфекционного ларинготрахеита птиц, болезни Ауески, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, парвовирусной инфекции свиней и других инфекций.

В настоящее время метод ДНК-зондов широко применяют для изучения геномов и составления генетических карт микроорганизмов.

Недостатками данного метода является:

1невозможно выявить возбудителя инфекции, еслиего концентрацияниже порогачувствительности метода, а такое встречается очень часто при хронических, латентных, и медленных инфекциях, в инкубационном периоде болезни либо когда вирус не культивируется вне чувствительного организма;

2 полное время анализа составляет одни сутки;

3 метод применим для выявления ДНК-вирусов.

3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Следующим шагом генодиагностики было создание способа исследования, названного полимеразной цепной реакцией (ПЦР), решившей выше перечисленные проблемы и открывшей новые возможности. Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К. Маллисом.

Современными характеристиками ПЦР является ее быстрота, непревзойденная чувствительность, высокая специфичность. Это позволяет надежно и к тому же количественно обнаруживать микроорганизмы, присутствующее в очень низких концентрациях (1-10 возбудителей в пробе). Нуклеиновые кислоты инфекционных агентов могут быть экстрагированы из любой биологической жидкости или ткани, а также из проб объектов окружающей среды (почва, вода и т. д.) и продуктов питания. Исходным материалом для ПЦР может быть ДНК, полученная обратной транскрипцией РНК, что позволяет использовать этот метод для индикации РНК-содержащих вирусов.

ПЦР — самый чувствительный метод прямого обнаружения инфекционных агентов, он не требует подобно серологическим реакциям иммунного ответа на проникновение возбудителя в организм хозяина. Это дает возможность следить за ранними стадиями развития инфекции, выявлять ее латентные стадии и обнаруживать не культивируемые формы вирусов, проводить оценку противовирусной терапии. ПЦР позволяетне только выявить патогенные микроорганизмы, но и быстро провестиих молекулярное тестирование, что является главным в диагностике и лечений инфекционных болезней.

Впервые ПЦР была разработана в медицине для диагностики ВИЧ-инфекций. В ветеринарии применяют ПЦР-тест системы для диагностики: парвовирусного энтерита свиней, лейкоза крупного рогатого скота, бешенства, чумы плотоядных, гриппа птиц, болезни Ауески и других вирусных инфекций.

В основе ПЦР лежит многократное копирование определенного фрагмента ДНК, специфичного для данного вида микроорганизма.. В результате происходит накопление ДНК фрагментов до токого количества, которое можно будет обнаружить другими методами (электрофорез, метод ДНК-зондов).                 

Подготовка исследуемого материала для ПЦР заключается в выделении тестируемой ДНК из материала (вируссодержащая суспензия) различными методами. Процедура включает: разрушение вируса и экстракцию нуклеиновой кислоты. Сначала готовят 10 % вируссодержащую суспензию из патологического материала по общепринятой методике. Затем проводят выделение ДНК. Для этого используют обработку протеазами, фенольнохлороформную экстракцию, нуклеосорбенты. В результате получают очищенную ДНК которую и используют в реакции.

Если нуклеиновая кислота получена от РНК-вируса то РНК переводят в ДНК используя фермент ревертазу (обратную транскриптазу), который добавляют к РНК вместе с нуклеотидами и выдерживают 1 час при температуре 37 С. В результате получаем копийную ДНК, которую и используем в ПЦР.

 Постановка ПЦР. Реакцию проводят в специальном аппарате — амплификаторе. В нем, согласно установленной программе, происходит автоматическая регулировка режимов (нагревание и охлаждение, поддержание определенной t° необходимое время).

Объем реакционной смеси составляет 100 мкл и включает деионизированную воду (50 мкл), 4 вида нуклеотидов, термостойкую ДНК полимеразу, полученуюя от бактерий гейзеров, исследуемуюДНК, соли КС1, МgСl₂ и детергент, 2 вида праймеров. Праймеры это специально синтезированные участки одноцепочной ДНК длиной 20-30 нуклеотидов, идентичные краевым участкам специфического фрагмента ДНК. Обязательно ставят + и — контроли.

ПЦР состоит из серии циклов (амплификаций), в каждомиз них происходит удвоение тестируемого участка ДНК. В свою очередь каждая амплификация состоит из этапов.                    

1 этап. Плавление ДНК. Пробирку с реакционной смесью нагревают до 90-95°С. При этом происходит раскручивание спирали ДНК, разрыв водородных связей между цепями и ДНК принимает одноцепочную форму (30 сек. — 1 мин.).

2 этап. Отжиг праймеров.. На этом этапе реакционную смесь охлаждают до 50-60°С и праймеры, находящиеся и реакционной смеси соединяются с комплиментарными участками на левой и правой границах специфического фрагмента одноцепочной ДНК (1-2 мин).

3 этап. Построение специфического фрагмента. При нагревании реакционной смеси до 70°С ДНК полимераза, достраивает участок ДНК до двухцепочной формы между праймерами из нуклеотидов реакционной смеси (1-2 мин).

 На этом первый цикл заканчивается. Образовавшиесяв первом цикле амплификации продукты синтеза служат материалом для второго цикла, по окончании которого и образуется искомый двухцепочный специфический фрагмент — ДНК-амплификат.

 В дальнейших циклах количество специфического фрагмента увеличивается в геометрической прогрессии, и в результате 30-35 циклов амплификации синтезируется 10⁸ копий фрагмента, что аналогично росту бактерии на искусственных средах.

 3.Обнаружение продукта амплификации. Для этого используют метод ДНК-зондов, описанный ранее или электрофорез.

Для проведения ПЦР в лаборатории должны быть специализированные, помещения, минимум два. Первая комната — пре ПЦР помещение. В нем проводят обработку клинических образцов — выделение ДНК, приготовление реакционной смеси, постановку самой реакции.

Вторая комната — пост ПЦР — помещение. В нем проводят обнаружение продуктов амплификации.

При работе следует соблюдать следующие условия: расстояние между помещениями должно быть как можно больше, исключается движение воздуха из 2-й комнаты в 1-ю; в каждом помещении должен быть свой персонал, набор реагентов, одноразовая посуда, нельзя проводить другие диагностические исследования. Обязательна обработка помещения до и после работы УФ- лучами 1 час. Это связано с тем, что продукты амплификации очень летучие соединения, поэтому возможна контаминация оборудования, посуды, рук и одежды сотрудников этими веществами и занос их в пробы и реакционную смесь, и как следствие искажение результатов ПЦР (ложно-положительные).

Задание. Составить схему проведения ПЦР.

Этапы выполнения задания:

1 посмотреть фильм «ПЦР»;

2 зарисовать схемой этапы постановки ПЦР.

                                     Вопросы и задания для контроля знаний

1 В чем заключается суть методов генодиагностики?

2 В чем состоит принцип метода ДНК-зондов?

3 Раскройте достоинства и недостатки метода ДНК-зондов.

4 В чем преимущества ПЦР и принцип постановки?

5 Назовите особенности проведения ПЦР.

6 Как проводят выделение тестируемой ДНК?

7 Как проводят ПЦР с выделенной РНК?

 

 Тема13 «СЕМЕЙСТВО РАБДОВИРУСы. Лабораторная диагностика бешенства»

Цель - систематизирование знаний о схеме и методах лабораторной диагностики бешенства и формирование навыков по обнаружению вируса бешенства в патологическом материале методом РДП.

 

             Материальное обеспечение

Схема РДП, плакаты: «Рабдовирусы, » «Бешенство», «Тельца Бабеша-Негри»; стерилизатор с инструментами, чашки Петри диаметром 30 мм, пробирки с агаром Дифко, спиртовка, пробойники для агара, иглы, пастеровские пипетки, ДАИ (диагностический антирабический иммуноглобулин), исследуемый материал, антиген вируса бешенства (положительный контроль), суспензия из мозговой ткани здорового животного (отрицательный контроль), Музейный препарат с тельцами Бабеша-Негри, вакцины против бешенства, презентация " Рабдовирусы", мультимедийное оборудование..

                  План

1 Порядок лабораторных исследований на бешенство.

2 Исследование материала на наличие антигена вируса бешенства в реакции диффузионной преципитации (РДП).

   

1 Порядок лабораторных исследований на бешенство

Диагноз на бешенство, как и на другие вирусных инфекций, ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков, патолого-анатомических изменений и результатов лабораторных исследований. Так как бешенство это зооантропозооноз, поэтому необходимо обратить внимание на правильность взятия и пересылки патологического материала в лабораторию и работы с ним.

В качестве патологического материала отправляют голову от крупных животных, свежие трупы мелких животных или их голову. Патологический материал должен быть тщательно упакован во влагонепроницаемый материал, в контейнер и опечатан. На него составляется сопроводительный документ. Направляют материал в лабораторию с нарочным.

Лабораторные исследования на бешенство проводят немедленно, вне очереди, а о предварительных и окончательных результатах сообщают ветеринарному специалисту приславшему материал и главному государственному ветеринарному инспектору района, области.

Исследования на бешенство проводят в течение 30 дней.

                 Подготовка патологического материала к исследованию.

В лаборатории работают с патологическим материалом только в специальном помещении, строго соблюдая правила техники безопасности: при вскрытии черепной коробки голову животного надежно фиксируют, Сотрудники работают в спецодежде ( две пары перчаток, очки, шестислойная защитная повязка на лицо, халат или комбинезон, бахилы, колпак).                 

Из патологического материала готовят:

1 мазки -отпечатки из каждого отдела головного мозга (аммоновы рога, мозжечок, кора больших полушарий, продолговатый мозг) с левой и правой сторон по 2 штуки;

2 вируссодержащую суспензию из всех проб отделов головного мозга.

                            Порядок исследований.

1 Исследование мазков отпечатков на наличие телец Бабеша-Негри проводят под световым микроскопом. Для этого мазки отпечатки окрашивают одним из методов ( по С.Н. Муромцеву, по Селлерсу или по Манну). При окраске по С.Н. Муромцеву мазки фиксируют этиловым спиртом в течение 1-2 часа, промывают дистиллированной водой и окрашивают синькой Мансона в разведении 1: 40. Без промывания обрабатывают 10% раствором танина 10 минут до появления голубого оттенка препарата. Затем мазки промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой, опускают в смесь спирта с ацетоном, опять высушивают и просматривают под световым микроскопом. В положительном случае наблюдают микрокартину: фон и цитоплазма клеток бледно голубые, ядра синие, эритроциты оранжево-красные, тельца Бабеша-Негри резко очерчены, фиолетовые с розовым оттенком и выраженной дольчатостью, располагаются в цитоплазме клеток или вне их. При окраске по Селерсу тельца Бабеша-Негри окрашиваются в пурпурно-красный цвет, а фон и клетки в синий цвет разных оттенков.

Обнаружение телец включений при бешенстве является достоверным показателем наличия вируса бешенства, но отсутствие их, что бывает в 15-35% случаев, не исключает болезни. В ряде случаев в головном мозге собак погибших от электротока или змеиного яда находят в нервных клетках образования, подобные тельцам Бабеша-Негри. Поэтому данный метод всегда подтверждают другими методами исследования.

Преподаватель демонстрирует под микроскопом музейный препарат с тельцами Бабеша-Негри.

2 Исследование мазков отпечатков МФА на наличие антигена вирусабешенства проводят прямым методом. Для этого мазки-отпечатки фиксируют в охлажденном ацетоне от 4 до 12 часов. Затем на препарат наносят флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин на 20-30 минут и отмывают в в фосфатном буфере и дистиллированной воде. Препарат высушивают и просматривают под люминесцентным микроскопом. При положительном результате обнаруживают вирусный антиген в виде ярких белых или зеленых гранул ( в зависимости от вида флуорохрома) до 10 в одном поле зрения при отсутствии свечения в контрольном препарате.

МФА является одним из основных тестов, при этом получают до 99-100 % совпадения с биопробой.

Вирус бешенства можно обнаружить данным методом, в тканях подчелюстной слюнной железы, в криосрезах проб кожи головы и луковиц сенсорных и тактильных волос морды. Кроме того МФА можно обнаружить вирус в клетках роговицы глаза, что позволяет поставить диагноз на бешенство при жизни животного.

МФА не подлежит исследованию материал консервированный глицерином, формалином, спиртом или имеющий признаки разложения, а также материал от животных после вакцинации в течение 3х месяцев.

3 Исследование материала на наличие антигена вируса бешенствав реакции диффузионной преципитации (РДП). 

РДП это серологическая реакция, основанная на взаимодействии вирусного антигена, в данном случае вируса бешенства, со специфическими антителами (антирабическим иммуноглобулином). Образовавшийся комплекс антиген-антитело выпадает в виде осадка — преципитата. Этот комплекс образуется в месте контакта диффундирующих навстречу друг другу гомологичных антигена и антител в агаровом геле в виде белой линии преципитации.

Компоненты реакции:

- антиген вируса бешенства;

- диагностический антирабический иммуноглобулин (ДАИ);

- мозговая ткань здорового животного;

- исследуемый материал ( мозговая ткань);

- агар фирмы «Дифко». 

                  Техника постановки РДП

Реакцию ставят на обезжиренных предметных стеклах, или в чашках Петри на (в) которые наслаивают расплавленный агар Дифко слоем 2-3мм. После застывания агара пробойником вырезают лунки согласно трафарету, в которые вносят пасту из мозговой ткани каждого отдела головного мозга, диагностический антирабический иммуноглобулин (ДАИ) в рабочем разведении, контроль положительный(антиген вируса бешенства) и контроль отрицательный ( мозговая ткань здоровых животных).

 После внесения всех компонентов, стекла с агаром помещают во влажную камеру, чашку Петри ставят в термостат с температурой 37 С на 6 часов, а затем на 18 часов оставляют при комнатной температуре.

Учет реакции проводят окончательно через 48 часов. В положительном случае между лунками с исследуемым материалом и диагностическим антирабическим иммуноглобулином образуются одна или две белых линии преципитации, представляющая собой комплекс антиген-антитело. При этом положительный антиген должен образовывать линию преципитации, а отрицательный нет.

РДП применяют только для исследования не консервированного мозга и даже не свежего.  Реакция проста и специфична, но выявляемость антигена вируса бешенства в патматериале составляет только 45-70%.

Отрицательные результаты вышеизложенных методов не дают основание исключить болезнь. В этих случаях окончательный диагноз на бешенство ставят по результатам биопробы с последующей идентификацией вируса.

4 Биопробу ставят чаще всего на белых мышах. 10% вируссодержащей суспезией заражают 8-12 мышат. Из них половину заражают интрацеребрально, в дозе 0, 03 мл и вторую половину подкожно в кончик носа в дозе 0, 05 мл. За животными ведут наблюдение 30 дней. В положительном случае на 10, 15, 20 день у мышей появляются клинические признаки: вялость, горбатость спины, взъерошенная шерсть, нарушение координации, паралич задних конечностей и гибель. Биопробу считают положительной если в мозге павших мышей обнаруживают тельца Бабеша-Негри или получают положительный результат исследования мозга в РДП или МФА. Биопробу считают отрицательной при отсутствии гибели мышей в течение 30 дней.

 Патологический материал от лис и от скунсов методом биопробы не исследуют, так как в их мозге и слюнных железах присутствует вещество подавляющее инфекционность вируса. Такой материал исследуют в МФА, РДП и другими методами.

  Для лабораторной диагностики бешенства можно применять и другие реакции.

-Реакция связывания комплимента (РСК) высокочувствительна и специфична, дает 99% совпадения с биопробой и обнаружением телец Бабеша-Негри, но является трудоемкой и долгой.

-В иммуноферментном аналезе (ИФА) можно исследовать и консервированный материал и замороженный, из которого готовят гистосрезы.

 -Реакцию нейтрализации (РН) проводят исключительно редко на мышах, в случае гибели всех мышей в биопробе без характерных признаков.

 5 Серологическая диагностика ( обнаружение антител к вирусу              бешенства в сыворотках крови) используется только для оценки поствакцинального иммунитета. Для этого используют РН на культуре клеток, РНГА, РТГА, ИФА.

Преподаватель знакомит студентов с препаратами применяемые для профилактики бешенства.

 

3 Исследование материала на наличие антигена вируса бешенства в реакции диффузионной преципитации (РДП)

Задание. Провести исследование патологического материала на наличие антигена вируса бешенства с помощью реакции диффузионной преципитации (РДП).

Этапы выполнения задания

1 Подготовить оборудование: пробирка с 1, 5% агаровым гелем, держатель для пробирок, спиртовка, чашка петри, трафарет для вырезания лунок, игла, пробирка с исследуемым материалом, пробирка с диагностическим антирабическим иммуноглобулином (ДАИ), пробирка с положительным антигеном –АГ+, пробирка с отрицательным антигеном –АГ-.

2 Поставит РДП.

2.1. Расплавить 1, 5% агаровый гель в пробирке над спиртовкой.

2.2 Вылить его в чашку Петри слоем 2-3 мми дать застыть.

2.3 Пробойником вырезать в агаре четыре лунки с расстоянием между центральной лункой и остальными 0, 5 см.

2.4 В центральную лунку пипеткой внести диагностический антирабический иммуноглобулин (ДАИ) 1-2 капли до краев лунки (не

⇐ Предыдущая123456Следующая ⇒

Поделиться: