Результат данного подсчета неприемлем.

Пример 4 - Подсчет (если для подсчета колоний установлено максимальное число, равное 150) дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) более 167 колоний на чашку (верхний предел доверительного интервала при средневзвешенном значении, равном 150):

- во втором выбранном разведении (10^-3) семь колоний.

Сообщают ориентировочное количество на основе колоний, подсчитанных в чашке с разведением 10^-3).

2. Если количество подсчитанных колоний (общее количество колоний, количество типичных колоний или количество презумптивных колоний) для каждой из чашек всех посеянных разведений дает значение свыше 300 (или любого другого числа, установленного в соответствующем стандарте), результат формулируют следующим образом: " Более 300/d" (в случае общего числа или числа типичных колоний) или " Более 300 х b А x 1/d" (в случав подтвержденных (идентифицированных) колоний), выраженных в количестве микроорганизмов на мл (для жидких продуктов) или в количестве микроорганизмов на г (для прочих продуктов).

где d - коэффициент разбавления последнего посеянного разведения;

b - число колоний, соответствующих критериям идентификации среди презумптивных колоний А.

3. Если чашка с последним засеянным разведением содержит от 10 до 300 колоний, то общее количество колоний, количество типичных колоний или количество презумптивных колоний N вычисляют по формуле

где с - число колоний, подсчитанных в чашке:

V- объем посевного материала, использованный для каждой чашки, мл.

d - выбранное разведение (коэффициент разбавления).

Результат округляют

За результат принимают число N микроорганизмов на мл (для жидких продуктов) или на г (для прочих продуктов).

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в последнем засеянном разведении (10^-4) 120 колоний.

После округления результата число N микроорганизмов равно 1200000 или 1, 2 х 10^-6 на мл или на г продукта.

Подсчет колоний дрожжей и плесеней

1. Подсчет колоний дрожжей и плесеней обычно проводят либо методом разливки сред, который позволяет облегчить задачу, либо методом подсчета при поверхностном посеве, который обеспечивает максимальное воздействие на клетки со стороны атмосферного кислорода и позволяет избежать теплового воздействия от расплавленного агара. Предварительно разлитый по чашкам агар перед посевом рекомендуется подсушить (см. ISO/TS 11133).

2. Некоторые дрожжи и плесени могут вызывать инфекционные заболевания или аллергические реакции даже у здоровых людей. В связи с этим необходимо проявлять особую осторожность при работе с ними.

3. Оптимальным вариантом является хранение чашек в термостате, а не в открытом помещении.

4. Крышки с чашек рекомендуется снимать только в случае крайней необходимости, обычно только при приготовлении предметных стекол для исследования под микроскопом.

5. Перед переносом материала прокаленные иглы необходимо остудить, чтобы избежать рассеивания конидий и других клеток. Рабочие столы и термостаты следует регулярно дезинфицировать.

6. Чашки Петри следует инкубировать в перевернутом положении и не трогать, пока на чашках не вырастет посевной материал для подсчета колоний. Это связано с тем, что перемещение чашек может приводить к освобождению конидий или спор плесени и последующему появлению колоний-спутников, приводя к повышенному подсчету популяции дрожжей и плесени.

7. Для подсчета берут чашки, содержащие от 10 до 150 колоний.

8. Если флора микроорганизмов состоит преимущественно из плесеней, выбирают чашки, в которых количество колоний ближе к нижней границе интервала.

9. Если флора микроорганизмов состоит преимущественно из дрожжей, для подсчета выбирают чашки, в которых количество колоний ближе к верхней границе интервала.

10. Если идентичность колоний вызывает сомнения, исследуют влажные препараты или окрашенные препараты клеток, не менее пяти колоний на образец, чтобы подтвердить, что бактерии отсутствуют.

§ 10

ПОДСЧЕТ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ЖИДКИХ СРЕД

Принцип

1. Пробы для анализа высевают в жидкую среду, предназначенную для поддержки роста конкретного микроорганизма или группы микроорганизмов и часто для подавления размножения прочих микроорганизмов.

2. Чтобы определить, происходит пи рост искомых микроорганизмов, можно использовать различные критерии, например визуальное обследование помутнения, выделение газа, изменение цвета, последующее выделение микроорганизмов на селективной агаризованной среде. Состав питательной среды и критерии для выявления различий положительного и отрицательного результатов определены в соответствующих стандартах.

3. Используя подобный подход, каждый образец для анализа может быть описан только качественно, значение, т. е. результат оценивается как положительный или отрицательный.

4. Чтобы установить количество присутствующих микроорганизмов, необходимо исследовать несколько проб образцов для анализа и использовать статистические методы для определения наиболее вероятного числа (НВЧ = MPN).

Посев

1. Если используют селективную питательную среду, добавление образца для анализа не должно уменьшать селективных свойств этой среды (тем самым способствуя росту прочих микроорганизмов).

2. Необходимо с осторожностью подходить к таким образцам, как специи, какао, бульон и т. д., поскольку они могут содержать подавляющие рост микроорганизмов вещества, в связи с чем требуют добавления нейтрализующих веществ, применения более высоких коэффициентов разведения, центрифугирования, фильтрования или иммуномагнитной сепарации для выделения искомых микроорганизмов из образца, даже если это специально не оговорено в соответствующих стандартах.

3. Несовместимость может также быть вызвана биологическим составом образца: сильно загрязненные от окружающей среды пробы, ферментированные продукты или продукты, содержащие пробиотики, очевидно, представляют большие проблемы микробиологу-аналитику, чем пробы, которые содержат очень незначительное количество микроорганизмов.

4. Для таких проблемных образцов рекомендуется выполнять эксперименты, используя контрольные микроорганизмы, чтобы подтвердить, что метод действительно подходит для анализа данного образца.

Проведение анализа

1. Если в соответствующих стандартах нет иных указаний, объемы образцов для анализа, менее или равные 1 мл, обычно добавляют к объему сред обычной концентрации, в 5 - 10 раз превышающему объем пробы для анализа. Пробы для анализа объемом 10 и 100 мл обычно добавляют к равным объемам сред двойной концентрации.

2. Для объемов, превышающих 100 мл, допускается использовать более концентрированные среды. Для особых целей стерильную обезвоженную среду можно растворить в холодном (или предварительно нагретом до 30 °С образце, подлежащем анализу.

3. Если нет иных указаний, время, прошедшее с момента приготовления первого разведения пробы и момента засева последней пробирки многолуночного планшета или флакона, должно составлять менее 15 мин.

4. Новую стерильную пипетку следует использовать для каждого разведения.

Выбор способа посева

1. Сущность метода наиболее вероятного числа (НВЧ) заключается в разбавлении пробы до такой степени, чтобы посевной материал не всегда содержал живые микроорганизмы. По " выходу", т. е. по количеству посевного материала, дающему рост в каждом разведении, будет оцениваться начальная концентрация бактерий в пробе. Чтобы получить оценку в широком диапазоне возможных концентраций, микробиологи используют серийные разведения, инкубируя в термостате по несколько пробирок (или чашек и пр.) каждого разведения. НВЧ (MPN) микроорганизмов, присутствующих на уровне исходной пробы, и точность оценки можно рассчитать с помощью статистических методов на основе числа положительных и отрицательных пробирок, полученных после инкубации в термостате.

2. Осуществляют выбор НВЧ из различных существующих конфигураций в соответствии.

- с ожидаемым числом микроорганизмов в анализируемой пробе.

- требованиями регламентов.

- требуемой точностью.

- другими практическими проблемами.

3. Неопределенность измерения зависит от числа положительных образцов для анализа, наблюдаемых практически одинаковым образом, поскольку неопределенность подсчета колоний зависит от числа колоний е чашке. Неопределенность измерения увеличивается как функция корня квадратного из числа использованных пробирок. Число пробирок необходимо увеличить в четыре раза для того, чтобы неопределенность измерения уменьшилась вдвое. Если используют способы только с небольшим числом дублируемых пробирок, неопределенность измерения низкая.

Способ одного разведения

1. Если ожидаемая концентрация микроорганизмов невелика или ожидается ее умеренное изменение, наиболее подходящим способом посева будет одна серия равных проб для анализа.

2. Там, где ожидаемое соотношение между максимальным и минимальным количеством микроорганизмов менее 25. десять параллельных проб для анализа являются наименьшим числом для работы; для 50 параллельных пробирок соотношение 200 является предельным. Примеры НВЧ для одного разведения приведены в таблицах

⇐ Предыдущая 1 23