КЛАССИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ПО ТИПУ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ ОПАСНОСТИ

§ 1

КЛАССИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ПО ТИПУ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ ОПАСНОСТИ

- 4-я категория риска (группа патогенности) (отсутствие риска или очень низкий риск для отдельного человека и общества). Вероятность заражения таким микроорганизмом человека или животного мала.

- 3-я категория риска (группа патогенности) (умеренный риск для отдельного человека, низкий риск для общества). Патоген, который может вызвать заболевание у человека или животного, но не представляющий серьезной угрозы для сотрудников лаборатории, общества или окружающей среды. Контакт с таким микроорганизмом в лаборатории может вызвать серьезную инфекцию у человека, но имеются способы эффективного лечения и профилактические меры, а риск распространения инфекции ограничен.

- 2-я категория риска (группа патогенности) (высокий риск для индивидуума, низкий риск для общества). Патоген, который обычно вызывает тяжелую болезнь у человека или животного, но обычно не распространяется от одного инфицированного индивидуума к другому. Существуют способы эффективного лечения и меры профилактики.

1-я категория риска (группа патогенности) (высокий риск для индивидуума и для общества). Патоген, который обычно вызывает тяжелую болезнь у человека или животного и легко передается от больного к здоровому человеку или животному прямым контактом или с помощью другого механизма передачи возбудителя. Эффективных способов лечения и профилактических мер обычно не существует.

Представителей 3-й и 4-й групп патогенности микроорганизмов часто обозначают как непатогенные или условно патогенные виды микроорганизмов, а патогены 1-й и 2-й групп патогенности относятся к возбудителям особо опасных инфекционных заболеваний.

§ 2

ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ

1. В помещениях, где проводят исследования образцов, не должны находиться мебель, документация и другие вещи, которые не применяются для проведения анализа. Документация, используемая в работе с образцами, должна храниться в закрытых шкафах или ящиках столов.

2. Лабораторная одежда должна быть застегнутой надлежащим способом, чистой, в хорошем состоянии, изготовленной из ткани, ограничивающей риск воспламенения. Эту одежду не следует носить вне рабочей зоны и, в частности, в ней нельзя выходить в туалет.

3. На волосы головы и бороду следует надеть защитные повязки.

4. Ногти следует содержать в чистоте и желательно короткими.

5. Необходимо мыть руки в теплой воде из нерегулируемого вручную крана до и после микробиологических исследований, а также после посещения туалета. Рекомендуется использовать жидкое или порошковое мыло или другое дезинфицирующее средство, поступающее из дозатора, поддерживаемого в чистом состоянии. Для сушки рук следует использовать одноразовые бумажные или матерчатые салфетки или полотенца. Эти предосторожности относятся как к персоналу лаборатории, так и посетителям.

6. При работе с открытыми пробами, питательными средами и при посеве материала не допускается разговаривать, кашлять и т. д.

7. Люди, имеющие инфекционные заболевания кожи или страдающие заболеваниями кожи, должны предпринимать меры предосторожности, если микроорганизмы от них способны заразить образцы, что может отразиться на результатах испытаний.

8. В лаборатории нельзя принимать пищу, пить, оставлять пищевые продукты для личного потребления в лабораторных холодильниках или морозильных камерах.

9. Запрещается осуществлять пипетирование ртом.

10. Рабочую зону очищают и обеззараживают после использования с помощью дезинфицирующего средства, руководствуясь инструкцией изготовителя.

11. Воздух помещений обеззараживают с использованием ультрафиолетовых (УФ) ламп.

§ 3

ОБРАБОТКА И ТРАНСПОРТИРОВКА ПРОБ

1. Проба должна быть защищена от постороннего загрязнения воздухом, от транспортировочного контейнера, от используемых устройств для осуществления отбора проб.

2. Четко и полностью необходимо идентифицировать пробы и регистрировать всю информацию о пробе.

3. Для достоверности результатов в лаборатории необходимо иметь сведения о температуре во время отбора пробы.

4. Если проба большая или находится в очень большом контейнере, для доставки в лаборатории применяют стерильный транспортировочный контейнер для проб, в котором переносят часть пробы, отобранную в стерильных условиях.

5. Стерильный контейнер может быть открыт только на время, необходимое для внесения в него образца, после чего его необходимо немедленно закрыть.

6. Способ транспортирования проб в лабораторию должен гарантировать сохранность.

7. Пробы в лабораторию доставляют быстро, поддерживая исходные условия хранения.

8. Проба должна быть упакована таким способом, чтобы не было повреждений упаковки или потери образца.

9. Если нет других указаний рекомендуют следующие температуры во время транспортирования:

- устойчивые продукты: окружающая температура (ниже 40 °С).

- замороженные или свежезамороженные изделия: ниже -15 °С. предпочтительно ниже -18 °С.

- другие изделия, не устойчивые при окружающей температуре: 1 °С - 8 °С.

Когда параметры условий транспортирования не определены, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны согласовывали продолжительность и температуру транспортирования.

При получении образцов необходимо проверить их состояние.

Если их состояние неудовлетворительное или если образцов недостаточно, лаборатория может отказаться от образцов.

10. Пробы, поступившие в лабораторию, регистрируют таким образом, чтобы можно было фиксировать их продвижение до момента составления протокола об их испытании. Идентичность и кодирование проб и отчетов должны обеспечивать прослеживаемость на всех стадиях испытаний в лаборатории.

11. Если необходимо, наружные поверхности контейнеров должны быть дезинфицированы при использовании соответствующих дезинфицирующих средств.

12. Образцы необходимо исследовать скорее после их получения, предпочтительно в течение 24 ч, или по согласованию с заинтересованной стороной.

13. Для быстропортящихся продуктов анализ необходимо начать в пределах 24 ч с момента отбора образца. Для скоропортящихся изделий (таких как рыба и сырое молоко) исследование необходимо начать в течение 36 ч.

14. Если крайние сроки испытания, упомянутые выше, нельзя выполнить, образцы можно заморозить при температуре ниже минус 15 °С, предпочтительно минус 18 °С. при условии, что на восстановление искомых микроорганизмов это не влияет и их количество изменится незначительно по сравнению с исходным продуктом.

§ 4

§ 5

ПОДСЧЕТ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПЛОТНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

1. Чашка Петри должна быть маркирована этикеткой, на которой указывают номер образца, разведение, дату посева и другую необходимую информацию.

2. Необходимо выбрать определенные разведения, чтобы обеспечить получение определенного количества колоний на чашках и преодолеть возможные ингибирующие свойства.

Для переноса каждого разведения используют отдельную стерильную пипетку, кроме случаев, когда работу ведут от самого высокого разведения к самым низким разведениям.

3. Количество чашек Петри на каждое разведение. В микробиологии пищевых продуктов обычно используют одну чашку на каждое разведение микроорганизмов согласно требованиям ISO/IEC 17025. В других случаях следует использовать две чашки для каждого разведения в соответствии с ISO 8199

. § 7

МЕТОДЫ ПОСЕВА В ЧАШКИ

Поверхностный посев

1. Методы посева, предназначенные для получения только поверхностных колоний на агаровых чашках, имеют некоторые преимущества по сравнению с методом разливки в чашки для выращивания микроорганизмов внутри агара. Микроорганизмы не подвергаются действию высокой температуры расплавленной агаровой среды, поэтому количество колоний может быть выше, а подсчет - более точным.

2. Используют предварительно заполненные агаровой средой чашки, толщина агарового слоя которых составляет не менее 3 мм. Слой агара должен быть ровным и не содержать пузырьков воздуха и поверхностной влаги.

3. Чтобы облегчить равномерное распределение, поверхность затвердевшего агара необходимо подсушить в соответствии с ISO/TS 11133 или, как определено другим соответствующим международным стандартом. В таком случае посевной материал абсорбируется в течение 15 мин.

Термостатирование

1. Если в соответствующих стандартах нет специальных оговорок, чашки после посева незамедлительно переворачивают и быстро помещают в термостат с установленной соответствующей температурой. Если происходит интенсивное обезвоживание (например, при 55 °С или в случае интенсивной циркуляции воздуха), чашки перед термостатированием неплотно укладывают в пластиковые пакеты или используют сходную систему равной эффективности.

2. Во время термостатирования неизбежно происходят незначительные колебания температуры, например во время загрузки и разгрузки термостата, и желательно, чтобы такие периоды занимали минимальное время. Продолжительность таких операций рекомендуется отслеживать, чтобы не допустить их заметного влияния на результат.

3. В определенных случаях, чтобы не спутать частицы исследуемого продукта с колониями микроорганизмов, полезно будет приготовить дубликаты засеянных чашек, которые хранят при температуре (3 ± 2) °С. для последующего сопоставления при подсчете с инкубированными засеянными чашками. Можно также использовать бинокулярное увеличительное стекло, чтобы отличить частицы продукта и колонии микроорганизмов.

4. Обычно чашки Петри составляют друг на друга, не более шести штук в стопке при аэробной инкубации. Стопки следует ставить друг от друга и от стенок термостата на расстоянии не менее 25 мм. Однако в термостатах, оснащенных системой циркуляции воздуха, высота стопок может быть больше, а расстояние между ними меньше: однако в этом случае необходимо проверять равномерность распределения температуры в термостате.

5. После термостатирования чашки следует немедленно исследовать. Однако их можно хранить, если нет иных указаний в соответствующих стандартах, до 48 ч е холодильнике.

6. Охлажденные чашки с некоторыми средами, содержащими индикаторные красители, рекомендуется привести в равновесие с условиями окружающей среды при комнатной температуре перед исследованием, чтобы обеспечить восстановление правильной окраски.

§ 8

Подсчет колоний

1. После термостатирования, установленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания, подсчитывают количество колоний (общее число колоний, число типичных колоний или предполагаемых колоний) на каждой чашке, содержащей менее 300 колоний (или другого количества, установленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания).

2. При подсчете типичных или предполагаемых колоний необходимо представить описание колоний, которое дано в соответствующем стандарте на конкретный метод испытания.

3. В определенных случаях подсчет колоний может быть затруднен (например, когда присутствуют распространяющие " ползучий рост" микроорганизмы). Такие сливные колонии рассматривают как отдельные колонии. Если менее четверти чашки заполнено таким сливным ростом, колонии подсчитывают на другой части чашки и рассчитывают по их количеству общее количество колоний в чашке. Посредством интерполяции выводится теоретическое число, которое должно соответствовать числу микроорганизмов на всей чашке.

4. Если сливной рост отмечается более чем на одной четверти чашки, то подсчет на такой чашке не проводится.

5. Колонии сливных (распространяющихся) микроорганизмов, выросших в форме цепочек, рассматривают как одну колонию.

6. В различных методах расчетов, приведенных необходимо принять во внимание чашки, не содержащие колоний, если такие чашки имеются.

§ 9

ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

В этой главе рассматриваются общие случаи:

- посев проводят на одной чашке Петри диаметром 90 мм для каждого разведения;

- максимальное количество всех присутствующих колоний на чашке составляет 300;

- максимальное общее число колоний (типичных и атипичных), присутствующих на чашке, при подсчете типичных или презумптивных колоний приблизительно равно 300 на чашку:

- максимальное число колоний для презумптивных колоний равно 150 на чашку;

- число презумптивных колоний, посеянных для идентификации или подтверждения, в каждой выбранной чашке обычно 5.

Такие цифры определены в соответствующих стандартах на конкретный метод испытания.

Если используются чашки с другим диаметром, отличным от 90 мм, максимальное число колоний должно возрастать или уменьшаться пропорционально площади поверхности чашки (или мембраны).

Методы расчета, приведенные ниже, применяются для тех случаев, которые встречаются наиболее часто, когда испытания проводятся в соответствии с установившейся лабораторной практикой.

Могут встречаться особые случаи (например, отношение коэффициентов разведения, использованное для двух последующих разведений, может заметно отличаться), и именно поэтому необходимо, чтобы полученные результаты подсчета изучал и трактовал квалифицированный микробиологии, при необходимости, не учитывал недостоверные результаты.

Особые случаи

Эти случаи касаются подсчета типичных и предполагаемых колоний.

Случай 1

Если число типичных и атипичных колоний для чашки с первым разведением d₁, превышает 300 (или какое-либо другое число, установленное в соответствующем стандарте на конкретный метод испытания) с выявленными типичными колониями или подтвержденными колониями и если чашка, содержащая последующее разведение d₂. содержит менее 300 колоний (или меньше любого другого числа, оговоренного в соответствующем стандарте) и не наблюдается типичных или подтвержденных колоний, результат сообщают следующим образом: " Менее 1/d₂, и более 1/d₁, микроорганизмов на мл" (для жидких продуктов) или " менее 1/d₂ и более 1/d₁, микроорганизмов на г" (для прочих продуктов).

где d₁, и d₂- коэффициенты разбавления, соответствующие разведению d₁, и d₂.

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) выявлено более 300 колоний на чашку, среди которых присутствуют типичные или подтвержденные колонии;

- во втором выбранном разведении (10^-3) выявлено 33 колонии, среди которых присутствуют типичные или подтвержденные колонии.

Случай 2

Если количество типичных и атипичных колоний в чашке с первым разведением d₁, превышает 300 (или какое-либо другое число, установленное в соответствующем стандарте), среди которых типичных или подтвержденных (идентифицированных) колоний не наблюдается, и если в чашке, содержащей последующее разведение d₂, выявлено менее 300 колоний (или какого-либо другого числа, установленного в соответствующем стандарте) и не выявлено типичных или подтвержденных (идентифицированных) колоний, результат сообщают следующим образом: " Менее 1\d₂ микроорганизмов на мл" (для жидких продуктов) или " Менее 1\d₂ микроорганизмов на г" (для прочих продуктов).

где d₂ - коэффициент разбавления, соответствующий разведению d₂;.

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в первой выбранном разведении (10^-2) выявлено более 300 колоний на чашку, среди которых нет типичных или подтвержденных колоний;

- во втором выбранном разведении (10^-3) 33 колонии, среди которых нет типичных или подтвержденных колоний.

§ 10

Принцип

1. Пробы для анализа высевают в жидкую среду, предназначенную для поддержки роста конкретного микроорганизма или группы микроорганизмов и часто для подавления размножения прочих микроорганизмов.

2. Чтобы определить, происходит пи рост искомых микроорганизмов, можно использовать различные критерии, например визуальное обследование помутнения, выделение газа, изменение цвета, последующее выделение микроорганизмов на селективной агаризованной среде. Состав питательной среды и критерии для выявления различий положительного и отрицательного результатов определены в соответствующих стандартах.

3. Используя подобный подход, каждый образец для анализа может быть описан только качественно, значение, т. е. результат оценивается как положительный или отрицательный.

4. Чтобы установить количество присутствующих микроорганизмов, необходимо исследовать несколько проб образцов для анализа и использовать статистические методы для определения наиболее вероятного числа (НВЧ = MPN).

Посев

1. Если используют селективную питательную среду, добавление образца для анализа не должно уменьшать селективных свойств этой среды (тем самым способствуя росту прочих микроорганизмов).

2. Необходимо с осторожностью подходить к таким образцам, как специи, какао, бульон и т. д., поскольку они могут содержать подавляющие рост микроорганизмов вещества, в связи с чем требуют добавления нейтрализующих веществ, применения более высоких коэффициентов разведения, центрифугирования, фильтрования или иммуномагнитной сепарации для выделения искомых микроорганизмов из образца, даже если это специально не оговорено в соответствующих стандартах.

3. Несовместимость может также быть вызвана биологическим составом образца: сильно загрязненные от окружающей среды пробы, ферментированные продукты или продукты, содержащие пробиотики, очевидно, представляют большие проблемы микробиологу-аналитику, чем пробы, которые содержат очень незначительное количество микроорганизмов.

4. Для таких проблемных образцов рекомендуется выполнять эксперименты, используя контрольные микроорганизмы, чтобы подтвердить, что метод действительно подходит для анализа данного образца.

Проведение анализа

1. Если в соответствующих стандартах нет иных указаний, объемы образцов для анализа, менее или равные 1 мл, обычно добавляют к объему сред обычной концентрации, в 5 - 10 раз превышающему объем пробы для анализа. Пробы для анализа объемом 10 и 100 мл обычно добавляют к равным объемам сред двойной концентрации.

2. Для объемов, превышающих 100 мл, допускается использовать более концентрированные среды. Для особых целей стерильную обезвоженную среду можно растворить в холодном (или предварительно нагретом до 30 °С образце, подлежащем анализу.

3. Если нет иных указаний, время, прошедшее с момента приготовления первого разведения пробы и момента засева последней пробирки многолуночного планшета или флакона, должно составлять менее 15 мин.

4. Новую стерильную пипетку следует использовать для каждого разведения.

Выбор способа посева

1. Сущность метода наиболее вероятного числа (НВЧ) заключается в разбавлении пробы до такой степени, чтобы посевной материал не всегда содержал живые микроорганизмы. По " выходу", т. е. по количеству посевного материала, дающему рост в каждом разведении, будет оцениваться начальная концентрация бактерий в пробе. Чтобы получить оценку в широком диапазоне возможных концентраций, микробиологи используют серийные разведения, инкубируя в термостате по несколько пробирок (или чашек и пр.) каждого разведения. НВЧ (MPN) микроорганизмов, присутствующих на уровне исходной пробы, и точность оценки можно рассчитать с помощью статистических методов на основе числа положительных и отрицательных пробирок, полученных после инкубации в термостате.

2. Осуществляют выбор НВЧ из различных существующих конфигураций в соответствии.

- с ожидаемым числом микроорганизмов в анализируемой пробе.

- требованиями регламентов.

- требуемой точностью.

- другими практическими проблемами.

3. Неопределенность измерения зависит от числа положительных образцов для анализа, наблюдаемых практически одинаковым образом, поскольку неопределенность подсчета колоний зависит от числа колоний е чашке. Неопределенность измерения увеличивается как функция корня квадратного из числа использованных пробирок. Число пробирок необходимо увеличить в четыре раза для того, чтобы неопределенность измерения уменьшилась вдвое. Если используют способы только с небольшим числом дублируемых пробирок, неопределенность измерения низкая.

Способ одного разведения

1. Если ожидаемая концентрация микроорганизмов невелика или ожидается ее умеренное изменение, наиболее подходящим способом посева будет одна серия равных проб для анализа.

2. Там, где ожидаемое соотношение между максимальным и минимальным количеством микроорганизмов менее 25. десять параллельных проб для анализа являются наименьшим числом для работы; для 50 параллельных пробирок соотношение 200 является предельным. Примеры НВЧ для одного разведения приведены в таблицах

Симметричный способ посева

1. В наиболее часто применяемом симметричном способе посева для определения НВЧ используют три или пять параллельных пробирок на разведение.

2. Точность, получаемая при применении этого способа, резко уменьшается по мере уменьшения числа пробирок на разведение.

3. Результаты с использованием трех пробирок являются не более чем показателями порядка значения концентрации.

4. Если требуется более высокая точность, рекомендуется использовать пять или больше параллельных пробирок. Примеры определения НВЧ с использованием трех и пяти пробирок приведены соответственно в таблицах.

Асимметричный способ

В асимметричных способах используют разное количество пробирок в разных разведениях. Применение таких способов пригодно только для оценки количества микроорганизмов в четко заданном диапазоне. Примеры приведены е ISO 8199.

Трактовка результатов

Критерии дифференциации положительных и отрицательных результатов различны для каждого типа микроорганизма или группы микроорганизмов и определяются в соответствующих стандартах на конкретный метод испытания. Используя эти критерии, подсчитывают и записывают число положительных результатов, полученных во всех образцах для анализа, взятых из одной лабораторной пробы.

Определение значений НВЧ

Существует три различных варианта определения значения НВЧ:

- вычисление по математическим формулам

- сопоставление с таблицами НВЧ

применение специальных компьютерных программ.

При условии, что эти методы основаны на одних и тех же статистических допущениях, все эти варианты равно достоверны. Эти три метода описаны ниже.

Таблицы НВЧ

Пример

Обработка результатов

По индексу НВЧ в таблице В.5 находят (согласно комбинации трех (или пяти) выбранных последовательных разведений) наиболее вероятное число (НВЧ) микроорганизмов в контрольном объеме.

Результаты представляют как наиболее вероятное число (НВЧ) микроорганизмов (или специфических групп микроорганизмов) на грамм или на миллилитр. Масса контрольного объема может быть представлена в г или см3 (например. 100 г или 100 см3).

§ 11