Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология
Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии 


Правила записи кариотипа при нарушениях кариотипа.




В 1960 году в американском городе Денвере была создана первая Международная система цитогенетической номенклатуры хромосом человека (An International System for Human Cytogenetic Nomen­clature - ISCN), обеспечившая международную стандартизацию исследований хромосом еще на начальных этапах становления цитогенетики человека. Хромосомный набор или кариотип человека включает 46 хромосом - 22 пары аутосом и 1 пару половых хромосом. Согласно данной номенклатуре хромосомы нумеруются от 1 до 23 по мере убывания их длины: с 1 по 22 - аутосомы, а 23 пара - половые хромосомы.

Запись кариотипа

46,ХХ или ХУ – норма.

46,ХХ+21 это дополнительная хромосома,т.е.трисомия, 46,ХХ-21 это моносомия,

inv - инверсия 46,ХУ,(16)(р13;q22),

r – кольцевая хромосома 46,ХУ, r(6)

t – транслокация 46,ХУ, t (2;18)(р31;q23)

del – делеция 46,ХУ, del(6)(р32)

rob – робертсоновская транслокация 46,ХУ, rob(14;21)(р10;р10)+21

ins – инсерция ins(5;11)

s+ есть спутник, ss появление двойных спутников

fra – ломкий фрагмент

qh+ qh- увелич/уменьш размера гетерохроматинового участка

dup -дупликация

 

 

Понятие о флуоресцентной in situ гибридизации (FISH).

1986 год. Метод определяет положение и типы ДНК непосредственно в местах их локализации в клетке или на хромосоме. Основа метода – наборы молекулярных зондов однонитчатой ДНК, способных избирательно гибридизировать со специально образующимися хромосомами. В результате – диссоциация нитей, зонты садятся на свои учатски и маркированы красителями. Таким образом происходит окраска последовательно ДНК, комплиментарным зондом.

Методика

1.приготовление зондов

2. зонды гибридизируют с комплиментарными участками ДНК и позволяют видеть локализацию генов в составе ДНК или хромосом.

приготавливают препараты интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию проводят в присутствии формамида, что позволяет снизить температуру денатурации до 70°

Далее к препарату добавляют зонды и осуществляют гибридизацию около 12 часов. Затем проводят несколько стадий отмывок для удаления всех негибридизовавшихся зондов.

Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флюоресцентного сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флюоресцентного красителя.

Этапы FISH

1. получение препаратов и их подготовка

2. мечение ДНК-пробы

3. гибридизация с ДНК-пробой

4.детекция ДНК-зонда

1)обработка РНКазой и пепсином, формамид, разрушение водородных связей и в результате получают одноцепочечные ДНК

2) денатурация ДНК-проб около 5 мин при 100градусахС,

3) гибридизация 20 часов


Микродиссекция

Микродиссекция, микропрепаровка - процесс разделения мелких структур при их микроскопическом изучении. С помощью миниатюрных хирургических инструментов, например, стеклянных скальпелей, выполняются различные перемещения механических соединений, благодаря чему уменьшается относительная неточность движений рук оператора во время осуществления им микродвижений. Таким образом обеспечивается возможность рассечения клеточных ядер и даже отдельных хромосом

Лазерная захватывающая микродиссекция — метод изоляции отдельных клеток с необходимыми характеристиками из биологических образцов ткани, позволяющий избежать возможных повреждений или изменений клетки либо минимизировать их. Прозрачная плёнка накладывается на образец, затем нужные клетки идентифицируются под микроскопом. Под воздействием лазерного луча клетки слипаются с плёнкой и вместе с ней вынимаются из образца для дальнейшего исследования. ЛЗМ позволяет избежать повреждений морфологии клетки и её химического состава, что делает этот метод оптимальным при изучении ДНК, РНК, белкового состава клетки. Среди возможных образцов — мазки крови, цитологические препараты, культуры клеток, и даже замороженные и парафинированные образцы


16. M-FISH (Multicolor или Multiplex FISH) является общим названием традиционных многоцветных FISH-методов с использованием комплектов флуорофор-специфичных фильтров. Принцип M-FISH заключается в раздельной цифровой регистрации сигнала всех используемых флуорофоров при последовательной смене комплектов фильтров. Обработка записанной информации, связанной с разделением сигнала и фона, а также с количественной оценкой сигнала, производится с помощью специального программного обеспечения, которое переводит информацию об уровне сигналов флуорофоров в каждой точке изображения в псевдоцвета. Одним из основных ограничений количества используемых ДНК-зондов является число доступных флуорофоров с неперекрывающимися спектрами возбуждения и эмиссии и наличие соответствующих комплектов фильтров.

Наиболее широкое распространение получил такой вариант M-FISH, как 24-цветный FISH, предназначенный для одновременной идентификации материала всех хромосом человека. Данный метод обладает высокой эффективностью при выявления хромосомных транслокаций, поскольку каждая пара хромосом окрашена в свой псевдоцвет, но не позволяет выявлять делеции и инверсии.


RxFISH

Метод многоцветного бэндинга хромосом (RxFISH) основан на межвидовой in situ гибридизации. Он позволяет непосредственно выявлять часть внутрихромосомных перестроек, осуществляя анализ всего генома человека в одном эксперименте. ДНК-зонды, используемые в RxFISH, помечены комбинацией 3-х флуорофоров, что обеспечивает 7 псевдоцветов. Они специфично окрашивают отдельные районы хромосом, создавая их цветную исчерченность. В результате интенсивных хромосомных перестроек, имевших место при формировании современных видов гиббонов, материал их хромосом оказался сильно перетасованным в сравнении с организацией хромосом у человека. При гибридизации участки ДНК разных хромосом, соединенные с различными флуорофорами, взаимодействуют с комлементарными участками ДНК на одной и той же хромосоме человека, создавая тем самым ее цветную исчерченность при изучении с использованием флуоресцентной микроскопии. К сожалению, применение RxFISH имеет достаточно серьезные ограничения. Так перестройки хромосом, имевшие место внутри одного цветного Rx-бэнда не могут быть выявлены с помощью этого метода, если они не приводят к значительным и легко видимым изменениям его размера. Более того, зонды окрашивают несколько хромосомных районов разных хромосом в один псевдоцвет. К недостаткам RxFISH можно также отнести большой размер многих цветных бэндов, в связи с чем, такие хромосомы человека, как 15, 18, 19, 21, 22, X и Y, представляют собой один цветной бэнд каждая. Использование в будущем большего числа флуорофоров и новых ДНК-зондов может значительно повысить разрешающие способности метода. Однако следует признать, что при увеличении числа используемых флуорофоров RxFISH, несомненно, будет более информативным, чем рутинный 24-цветный М-FISH.

Основные принципы анализа микроскопических изображений при спектральном кариотипировании (SKY) практически не отличаются от используемых при M-FISH. Отличия связаны со способом регистрации изображения, требующим точного описания спектральных характеристик объекта. В ходе одного измерения получают спектральные кривые для всех точек изображения. Для спектрального кариотипирования всех хромосом человека используют пять флуорофоров: один в зеленом спектре, два в красном и два в инфракрасном. В одном акте экспозиции одновременно для каждой точки изображения записывается полная спектральная характеристика испускаемого света. На основании анализа спектральных кривых определяется наличие или отсутствие в данной точке конкретных флуорофоров. Следующим шагом является процедура классификации, выполняемая с помощью специального программного обеспечения, позволяющего определять хромосомную принадлежность анализируемого материала. Большим достоинством SKY является то, что параллельно можно анализировать спектральные изображения и качественную дифференциальную окраску хромосом, это значительно упрощает интерпретацию результатов SKY и позволяет более точно определять точки хромосомных разрывов.


Виды ДНК-проб.

Основным методом выявления последовательности оснований в цепочке ДНК является ядерная проба, или ДНК-проба. В основе этого метода лежит стремление одноцепочечной ДНК соединяться с цепочками ДНК, имеющими последовательности, комплементарные последовательностям исходной цепочки. Если вы ищете последовательность А-Т-Ц-Г-Г, то будете использовать пробу, содержащую последовательность Т-А-Г-Ц-Ц. Образующуюся в результате двойную цепь ДНК называют гибридной, потому что она представляет собой сочетание «натуральной» ДНК и «искусственной» ДНК-пробы. Стадия гибридизации представляет собой простое смешивание одноцепочечных проб с целевой ДНК.

Сначала необходимо денатурировать ДНК. Денатурация ДНК происходит при ее нагревании. При этом двойная цепь разъединяется на две цепочки, что позволяет одноцепочечным пробам найти комплементарные участки и соединиться с ними.

Применение ядерной пробы часто совмещают с методом анализа фрагментов ДНК, называемым Саузерн-блоттинг. Благодаря человеческой природе мы теперь имеем Нозерн-блоттинг, применяемый для анализа РНК, и Вестерн-блоттинг, используемый для анализа белков.

Для Саузерн-блоттинга нужно сначала разделить исследуемый участок ДНК на небольшие фрагменты. Чтобы разрезать ДНК, используют рестриктазы. Вы сможете определить последовательность ДНК по сайтам, где происходит разрезание цепи. Образовавшиеся фрагменты ДНК затем подвергают гель-электрофорезу. Электрофорез — это аналитический метод разделения молекул, основанный на различиях в их размере и/ или электрическом заряде. При воздействии электрического тока, пропускаемого через гель, исследуемые соединения перемещаются в геле. Скорость, с которой молекулы передвигаются, зависит от величины их заряда: они реагируют на электрическое поле в зависимости от того, насколько сильно заряжены. Скорость передвижения молекул также зависит от их размера. Небольшим соединениям легче передвигаться в геле, чем большим. Различные фрагменты анализируемой ДНК вы помещаете на одном конце геля в специально предназначенные для этого карманы. Каждый фрагмент — в отдельном кармане. Затем включаете электрический ток, далее Погрузите гель в этидиум бромид (EtBr) — флуоресцентный краситель, который связывается с ДНК. Когда вы посмотрите на гель в ультрафиолетовом свете определенной длины волны, то увидите фрагменты ДНК. Этидиум бромид показал все фрагменты, но вам необходимо знать, какой фрагмент связался с пробой. Для этого заранее надо снабдить пробу радиоактивной или флуоресцентной меткой. Один из способов обнаружения нужных молекул — система соединенных антител и флуорохромов. Этот метод получил название флуоресцентной in situ гибридизации. Можно синтезировать пробы с встроенными флуоресцентными молекулами или молекулами, которые определяются с помощью флуоресцентных антител. Таким образом, становится возможной прямая визуализация проб. высушите гель на системе фильтров, чтобы обеспечить твердую основу для образцов при дальнейшем анализе.

Применяя этот анализ, вы узнаете о локализации специфичных последовательностей ДНК благодаря использованию определенных рестриктаз, а также о локализации последовательности оснований, комплементарной пробе во фрагменте ДНК.


19. Геномный импринтинг — эпигенетический процесс, при котором экспрессия определённых генов осуществляется в зависимости от того, от родителя какого пола поступил аллель гена. Наследование признаков, определяемых импринтируемыми генами, происходит не по Менделю. Импринтинг генов осуществляется с помощью процесса метилирования ДНК, в результате чего транскрипция гена блокируется. Если по каким-то причинам импринтинг не сработает, это может привести к появлению генетических нарушений (синдром Прадера-Вилли и Ангельмана)

Синдром Ангельмана — генетическая аномалия. Для него характерны задержка психического развития, нарушения сна, припадки, хаотические движения (особенно рук), частый смех или улыбки.

При синдроме Ангельмана отсутствуют некоторые гены из 15-й хромосомы (в большинстве случаев — частичная делеция либо другая мутация 15 хромосомы). При синдроме Ангельмана страдает материнская хромосома; Кариотип 46 XX или XY, 15р−. Обычно синдром вызывается спонтанным хромосомным дефектом, когда отсутствует большая смежная область из 3—4 миллионов пар оснований ДНК в области q11—q13 15-й хромосомы.

Согласно результатам многих независимых исследований, причиной возникновения синдрома Ангельмана может являться мутация в гене UBE3A. Продукт этого гена — ферментный компонент сложной системы деградации белков. Синдром назван по имени британского педиатра Гарри Ангельмана, впервые описавшего его в 1965 г. Частота встречаемости, по разным данным, — 1 : 10 000—20 000 живорожденных младенцев.

В случае повреждения отцовской хромосомы возникает синдром Прадера-Вилли.Это редкая генетическая аномалия. При синдроме Прадера — Вилли отсутствуют или не экспрессируются примерно 7 генов из 15-й хромосомы, унаследованной от отца. Кариотип 46 XX или ХУ, 15q-11-13. Синдром впервые описали в 1956 г. Частота встречаемости — 1 : 12 000 — 15 000 живорождённых младенцев.





Рекомендуемые страницы:


Читайте также:

  1. AT : химич. Природа, строение, свойства, механизм специфического взаимодействия с АГ
  2. AVC достигают макс. величины при этом объеме
  3. Aбстрактные классы, используемые при работе с коллекциями
  4. E) может быть необъективным, сохраняя беспристрастность
  5. E) Способ взаимосвязанной деятельности педагога и учащихся, при помощи которого достигается усвоение знаний, умений и навыков, развитие познавательных процессов, личных качеств учащихся.
  6. Else write('не принадлежит')
  7. else write('не принадлежит')
  8. Gerund переводится на русский язык существительным, деепричастием, инфинитивом или целым предложением.
  9. I. Общие обязанности машиниста перед приёмкой состава в депо.
  10. I. Понятие и система криминалистического исследования оружия, взрывных устройств, взрывчатых веществ и следов их применения.
  11. I. Предприятия крупного рогатого скота
  12. I. Прием и отправление поездов


Последнее изменение этой страницы: 2016-04-11; Просмотров: 1588; Нарушение авторского права страницы


lektsia.com 2007 - 2020 год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! (0.01 с.) Главная | Обратная связь