Нитрификация и денитрификация

⇐ ПредыдущаяСтр 5 из 5

1.1 Цель работы: познакомиться с возбудителями процессов нитрификации и денитрификации и с продуктами, образующимися в ходе данных процессов

Задание

1. Получить накопительную культуру нитрифицирующих микроорганизмов.

2. Провести качественные реакции на нитриты с реактивом Грисса

3. Провести качественную реакцию на нитраты с дифениламином.

4. Приготовить фиксированные препараты нитрозных и нитратных бактерий, микроскопировать их с иммерсией.

5. Получить накопительную культуру денитрифицирующих микроорганизмов и провести анализ среды.

6.Приготовить препараты денитрифицирующих бактерий, промикроскопировать их с иммерсией.

1.3 Приборы, посуда, реактивы: микроскопы, красители, реактивы: Несслера и Грисса, концентрированная серная кислота, дифениламин, (NH₄)₂SO₄; MgSO_4, NaCl, FeSO_4, CaCO₃ – 5, 0, NaNO_2, Na₂CO_3, NaCl, K₂HPO_4, MgSO₄, FeSO₄; цитрат K или Na (трехзамешанный)-5, 0; KNO₃-2, 0; аспарагин-1, 0; KH₂PO₂-2, 0; MgSO₄^.7H₂O-2, 0; CaCO₂^.6H₂O-0, 2; FeCl₃^. H₂O – следы, pH 6, 8-7, 2. почва_; фарфоровые чашки, пипетки.

Нитрификация. Многие почвенные и водные бактерии способны использовать в качестве доноров водорода неорганические соединения и ионы, т.е. способны окислять эти неорганические вещества: NH₃, (NH₄⁺), NO₂^–, H₂S, тиосульфат – Na₂S₂O_3,сульфит – SO₃^2–, ионы двухвалентного железа – Fe^{2 +} или марганца – Mn^{2 +}, элементарную S и молекулярный H_2.В результате их окисления микроорганизмы получают энергию для синтетических процессов и из углерода CO₂ синтезируют все органические вещества своей клетки. Таким образом, эти микроорганизмы не нуждаются в органических соединениях ни для катаболических, ни для анаболических процессов. Такой обмен веществ, встречающийся только у микроорганизмов, называется хемосинтезом. Такие микроорганизмы относятся к хемолитоавтотрофам. Хемосинтез был открыт С.Н.Виноградским в 1887 г. при изучении процесса нитрификации.

Процесс окисления аммиака в нитраты называется нитрификацией. Изучение процесса важно потому, что он связан с накоплением в почве нитратных форм азота, которые необходимы для питания растений, и является необходимым этапом круговорота азота в природе. Процесс нитрификации протекает в 2 фазы и ведут его соответственно две группы нитрифицирующих бактерий.

Первая фаза нитрификации заключается в окислении аммиака и солей аммония до азотистой кислоты:

NH3 (NH4⁺) + ½ O₂ → NO₂^– + 2H⁺ + 279 кДж + H₂O

Этот процесс ведут нитрозные бактерии родов: Nitrosomonas, Nitrosolobus, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosovibrio.

Вторая фаза нитрификации заключается в окислении азотистой кислоты до азотной:

NO₂^– + ½ O₂ → NO₃^– + 71, 4 кДж

Вторую фазу ведут нитратные бактерии родов: Nitrobacter, Nitrospira.

Ход работы.Для накопления нитрифицирующих бактерий пользуются питательной средой Виноградского (г/л дистиллированной воды):

Для 1-ой фазы: (NH₄)₂SO₄ – 2, 0; MgSO₄ – 0, 5; NaCl – 2, 0; FeSO₄ – 0, 4; CaCO₃ – 5, 0.

Для 2-ой фазы: NaNO₂ – 1, 0; Na₂CO₃ – 1, 0; NaCl – 0, 5; K₂HPO₄ – 0, 5; MgSO₄ – 0, 5; FeSO₄ – 0, 4.

Элективность создается отсутствием органических веществ в среде. Раствор при хорошем взбалтывании (т.к. в нем есть осадок) разливают по 30 мл в колбы на 150 мл. Колбы заражают небольшим количеством свежей почвы, закрывают ватными пробками и помещают в термостат при температуре 25-28⁰С на 10-14 дней.

1-я фаза нитрификации.

О ходе процесса нитрификации судят по изменению состава питательной среды в колбах. В колбе со средой для первой фазы нитрификации проверяют наличие аммиака реактивом Несслера и образование азотистой кислоты с реактивом Грисса.

Качественная реакция на нитриты: в пробирку наливают 10 капель реактива Грисса и добавляют 1, 5-2 мл исследуемого раствора. При наличии нитритов появляется розовое окрашивание. Если нитритов мало, то окраска возникает только после нагревания.

Для получения накопительной культуры нитрозных бактерий поступают следующим образом. Когда весь аммиак в колбе с питательной средой будет окислен (пробу на аммиак проводят реактивом Несслера), прибавляют в колбу новую порцию его (1 мл 10%-ного раствора (NH₄)₂SO₄) и после полного окисления повторяют эту операцию несколько раз, пока культурная жидкость не обогатиться достаточным количеством нитрозных бактерий. После чего проводят микроскопическое исследование нитрозных бактерий. Для этого из накопительной культуры готовят фиксированный окрашенный фуксином препарат и рассматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Препарат зарисовывают.

2-я фаза нитрификации.

За ходом второй фазы нитрификации следят по исчезновению нитритов, используя для этого реактив Грисса, и по появлению азотной кислоты, используя дифениламин в растворе концентрированной серной кислоты.

Для получения накопительной культуры нитратных бактерий в колбу со средой добавляют свежую порцию NaNO₂ (0, 5 мл 10%-ного раствора NaNO₂) после полного окисления нитритов. Повторяют эту операцию несколько раз.

Качественная реакция на нитраты. Для этого на дно фарфоровой чашки помещают несколько кристалликов дифениламина, на них осторожно капают несколько капель концентрированной серной кислоты и рядом наносят 1-2 капли исследуемого раствора. При наличии нитратов возникает синяя полоса на границе соприкосновения растворов.

О накоплении нитритов и нитратов в среде судят по интенсивности окраски, отмечая степень окраски крестами: +-слабая, ++-средняя, и +++-сильная окраска. Результаты опыта вносят в таблицу 5.

Таблица 5 Степень накопления продуктов нитрификации и денитрификации

Вариант опыта	Наличие аммиака	Наличие нитритов
1 фаза нитрификации следы +++ 11 фаза нитрификации - - 111 Денитрификация + +

Из накопительной культуры нитратных бактерий готовят фиксированный окрашенный фуксином препарат и микроскопируют с объективом 90х. Препарат зарисовывают.

Денитификация. Это обратный процесс нитрификации. Микроорганизмы из родов Pseudomonas, Micrococcus, Achromobacer способны в своем энергетическом обмене окислять различные органические вещества при одновременном сопряженном восстановлении нитратов и нитритов до молекулярного азота. Этот процесс получил название прямой или истинной денитрификации. Восстановление нитратов до молекулярного азота идет через ряд промежуточных продуктов с помощью фермента нитратредуктазы:

NO₃^–→ NO₂^–→ NO → N₂O → N₂

В общем виде:

5 C₆H₁₂O₆+24 KNO₃ → 24 KHCO₃+6 CO₂+18 H₂O+12 N₂

Глюкоза окисляется до CO₂ и H₂O, селитра восстанавливается до бикарбонатной соли и N₂. Окисление идет за счет кислорода селитры. При восстановлении нитратов в среде остаются ионы K⁺ или Na⁺, поэтому денитрификация всегда сопровождается подшелачиванием среды. Денитрифицирующие бактерии распространены во влажных слабоаэрированных почвах с высоким содержанием органических веществ.

Для культивирования денитрификаторов готовят среду Гильтея следующего состава (г/л дистиллированной вод): цитрат K или Na (трехзамешанный)-5, 0; KNO₃-2, 0; аспарагин-1, 0; KH₂PO₂-2, 0; MgSO₄^.7H₂O-2, 0; CaCO₂^.6H₂O-0, 2; FeCl₃^. H₂O – следы, pH 6, 8-7, 2. Среду наливают в высокие пробирки на 2/3 объема, заражают небольшим количеством почвы и помещают в термостат при температуре 30⁰С на 6-7 дней. Далее приступают к анализу среды. Отмечают помутнение жидкости в пробирках, выделение газов (CO₂ и N₂), исчезновение нитратов с дифениламином и нитритов с реактивом Грисса, появление аммиака с реактивом Несслера. Данные вносят в таблицу 5. Проверяют pH среды с помощью универсального индикатора или с бромтимолблау. Из жидкости в пробирках готовят фиксированный окрашенный фуксином препарат и микроскопируют. В поле зрения микроскопа видна масса мелких палочковидных клеток, неспорообразующих, располагающихся одиночно, скоплениями, либо в виде коротких цепочек. Препарат зарисовывают.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Градова Н.Б., Бабусенко Е.С., Горнова И.Б., Гусарова Н.А. Лабораторный практикум по общей микробиологии. – М.: ДеЛи принт, 2001.- 144 с.

2. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии.-М.: Изд-во МГУ, 1976.- 304 с.

3. Емцев В.Т. Мишустин Е.Н., Микробиология. – М.: ДРОФА, 2005.- 448 с.

4. Практикум по микробиологии: учеб.пособие; под ред.проф.А.И.Нетрусова. –М.: ACADEMIA, 2005.-608 c.

5. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. – М.: Колос, 1993.- 176 с.

⇐ Предыдущая 1 2 3 45