Микроорганизмы, разрушающие целлюлозу (клетчатку). Уксуснокислые бактерии

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 5Следующая ⇒

1 Микроорганизмы, разрушающие целлюлозу

1.1 Цель работы изучить возбудителей анаэробного разрушения целлюлозы и уксуснокислого брожения.

Задание

1. 1.Получить накопительную культуру анаэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов.

2. Приготовить фиксированный препарат целлюлозоразрушающих бактерий. Микроскопировать с объективами 20х 40х.

3. Получить накопительную культуру бактерий, вызывающих уксуснокислое брожение.

4. Провести качественную реакцию на уксусную кислоту.

5. Приготовить фиксированный препарат уксуснокислых бактерий, микроскопировать с иммерсией.

1.3 Приборы, посуда, реактивы. Круглые плоскодонные колбы, конические колбы объемом 100-150 мл, корковые пробки к ним, полоски фильтровальной бумаги; KNH2₄HPO_4,; KH₂PO₄; CaCl₂; MgSO₄; пептон; CaCO₃; почва или навоз; пиво, предметные стекла, микробиологические петли, красители (фуксин или генциановый фиолетовый), микроскоп, 10%-ный раствор соды, FeCl_3.

Целлюлоза (клетчатка) является главной составной частью растительного материала и на ее долю приходится от 40 до 70 % сухой массы растений. Отмершие части растений попадают в почву и там подвергаются разрушению. Разрушение целлюлозы ведут бактерии, грибы и актиномицеты. Трансформация клетчатковых масс идет в разных условиях аэрации, при неодинаковой температуре и при различной pH среде.

Под действием фермента целлюлазы клетчатка гидролизуется до целлобиозы, далее целлобиоза под влиянием фермента целлобиазы расщепляется до глюкозы. Схематично это процессы могут быть выражены следующим образом:

(С₆Н₁₀О₅₎_n → nC₁₂H₂₂O₁₁ → C₆H₁₂O₆

Глюкоза в аэробных условиях окисляется микроорганизмами до оксикислот, а затем до конечных продуктов – CO₂и H₂O c выделением большого количества энергии:

С₆H₁₂O₆ → R-CHOHCOOH → CO₂+H₂O+Q кДж

В анаэробных условиях глюкоза сбраживается по типу маслянокислого брожения:

С₆H₁₂O₆ → CH₃CH₂CH₂COOH + CO₂ + H₂ + Q кДж

Состав конечных продуктов может быть различным в зависимости от вида микроорганизма, ведущего процесс разрушения целлюлозы. В аэробных условиях наиболее активно разрушают клетчатку бактерии порядка Myxobacteria, Cythophagales. Помимо бактерий, в аэробном разрушении целлюлозы участвуют грибы родов Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Cladosporium, Trichoderma, Chaetomium. Среди актиномицетов описано лишь немного целлюлозоразлагающих видов: Micromonospora chalcea, Streptomyces cellulosae.

В анаэробных условиях процесс разложения клетчатки идет за счет мезофильных и термофильных бактерий рода Clostridium.

Ход работы Выделение анаэробных целлюлозоразрушающих бактерий.

Для получения накопительной культуры бактерий используют питательную среду следующего состава (в %): KNH₄HPO₄ –0, 2; KH₂PO₄ –0, 1; CaCl₂– 0, 03; MgSO₄–0, 05; пептон –0, 1; CaCO₃–0, 5; pH – среды 7, 0-7, 4.

Опыт по брожению целлюлозы ставят таким образом: в круглую плоскодонную колбу вносят 1-2 г фильтровальной бумаги (или вату), нарезанной мелкими полосками, и заливают средой. Стерилизацию колбочек с питательной средой проводят в автоклаве при давлении 1 атм 20 мин. и после остывания заражают комочком почвы или навоза, закрывают корковыми пробками с отверстием для выхода газов.

Элективные условия в данном случае определяются следующими факторами: во-первых, клетчаткой (источник углерода), которая может потребляться только специфическими целлюлозоразлагающими бактериями, имеющими фермент целлюлазу.; во-вторых, анаэробиозом.

Пептон, введенный в среду в небольшом количестве, практически не нарушает элективности среды, но сильно стимулирует процесс.

Через несколько дней при температуре 30-35⁰С начинается брожение клетчатки, которое длится 2-3 недели. Полоски фильтровальной бумаги желтеют, ослизняются, постепенно превращаются в амфорную массу, и оседают на дно.

Разрушенные массы клетчатки подвергаются микроскопическому анализу. Микробиологической петлей разрушенную клетчатку переносят на предметное стекло в каплю жидкости из пробирки и делают мазок. Окрашивают фуксином или генциановым фиолетовым и микроскопируют, пользуясь объективом 90х.

В поле зрения микроскопа видны длинные палочки, спорулирующие клетки типичной плектрициальной формы и свободнолежащие споры. Препарат зарисовывают.

2 Уксуснокислые бактерии.Уксуснокислым бактериям присуща способность к образованию кислот путем неполного окисления сахаров или спиртов. Эти бактерии грамотрицательные с перитрихиально (Acetobacter) или полярно (Acetomonas) расположенными жгутиками, подвижные, широко распространены в природе. Они встречаются на фруктах и овощах, в пиве. Уксуснокислые бактерии ведут процесс окисления этилового спирта в уксусный альдегид и далее в уксусную кислоту. Процесс идет в строго аэробных условиях:

C₂H₅OH+O₂ → CH₃COOH+H₂O+494 кДж.

Ход работы. В конические колбы наливают тонкий слой пива (0, 5-1, 0 см). Толщина слоя пива имеет большое значение для исхода опыта, так как для уксуснокислых бактерий должны быть созданы аэробные условия. Колбы закрывают ватными пробками и ставят в термостат при температуре 30⁰С на 5-7 суток.

На следующем занятии колбы просматривают, описывают характер образовавшихся пленок, микроскопируют окрашенные мазки, делают качественную реакцию на уксусную кислоту. Для этого жидкость нейтрализуют 10%-ным раствором соды и добавляют немного раствора хлорида железа. Смесь нагревают. При наличии уксусной кислоты появляется красное окрашивание из-за образования ацетата железа (III).

Лабораторная работа № 12

Аммонификация белка и мочевины

1.1 Цель работы – изучить свойства аммонифицирующих бактерий, провести качественные реакции на продукты распада белков и мочевины.

Задание

1. Получить накопительную культуру аммонифицирующих микроорганизмов.

2. Провести качественные реакции для выявления продуктов гнилостного распада белков.

3. Провести микроскопическое исследование гнилостных бактерий.

4. Получить накопительную культуру уробактерий и провести качественные реакции по выявлению продуктов распада мочевины

5. Провести микроскопическое исследование уробактерий.

1.3 Приборы, посуда, реактивы. Круглые плоскодонные колбы; полоски фильтровальной бумаги, смоченные 10 %-ным раствором уксуснокислого свинца – Pb(CH₃COO)_2; красная лакмусовая бумажка; реактив Несслера; МПБ, пептон; почва, навоз; K или Na винокислый (яблочнокислый, лимоннокислый); мочевина, K₂HPO_4,; MgSO_4,микроскоп, предметные стекла, микробиологические петли, красители (фуксин или генциановый фиолетовый).

Аммонификация белка. Органические соединения, содержащие белки, попадая в почву и водоемы, подвергаются минерализации с помощью микроорганизмов, образующих протеолитические (протеаза и пептидаза) ферменты. Процесс гидролиза белков или аммонификация происходит следующим путем: белок → пептон → полипептиды → аминокислоты → NH₃. Кроме того, образуются CO₂, H₂S, H₂O и другие продукты неполного распада – индол, скатол, меркаптан. Процесс аммонификации происходит в широком диапозоне температурных условий и аэрации.

К аммонификации способны многие виды бактерий, актиномицетов и грибов. Сильными аммонификаторами являются следующие спорообразующие аэробные бактерии: Bacillus subtilis, Bac.mesentericum; бесспоровые аэробы - Proteus vulgaris и спорообразующие анаэробы - Clostr.putrificus. Это бактерии называются аммонифицирующими или гнилостными, которые хорошо растут на МПА.

Ход работы Определение продуктов гнилостного распада белков.

1.Проба на аммиак. Накопительную культуру аммонифицирующих бактерий получают на мясном бульоне с добавлением 2% пептона. Среду наливают высоким слоем в колбы, плотно закрывают ватными пробками и стерилизуют. Среду заражают комочками почвы и ставят в термостат при 28⁰С на 3-4- дня. Для каждой подгруппы - по одной колбе. Под пробки подвешивают влажную красную лакмусовую бумажку и полоску фильтровальной бумаги, смоченной раствором уксуснокислого свинца.

Аммиак обнаруживается с помощью красной лакмусовой бумажки, которая становится синей, и при помощи реактива Несслера. Для этого в фарфоровую чашку к нескольким каплям жидкости из колбы добавляют каплю реактива Несслера. В присутствии следов аммиака жидкость окрашивается в желтый цвет, при большом количестве аммиака образуется коричневый (бурый) осадок.

2.Проба на сероводород. Сероводород обнаруживается с помощью подвешенной под пробкой колбы полоски фильтровальной бумаги, смоченной 10 %-ным раствором уксуснокислого свинца – Pb(CH₃COO)₂, бумажка должна почернеть.

3.Микроскопическое исследование гнилостных бактерий. Для этого сначала готовят препарат «раздавленная капля», а затем фиксированный окрашенный фуксином или генциановым фиолетовым препарат. Все виды бактерий зарисовывают.

Аммонификация мочевины. Процесс аммонификации мочевины заключается в разложении ферментом уреазой мочевины, выполняемой уробактериями, по следующей реакции:

CO(NH₂)₂ + 2H₂O → 2NH₃+ CO₂ +H₂O.

Фермент уреазу образуют бактерии, грибы и актиномицеты. Активные представители - Sporosareina urea, Micrococcus urea.

Ход работы. Для накопления уробактерий используют синтетическую среду следующего состава (в г/л дистиллированной воды): K или Na виннокислый (яблочнокислый, лимоннокислый) - 5, 0; мочевина – 5, 0; K₂HPO₄ – 0, 2; MgSO₄- 0, 5. Среду разливают в колбы на 100 мл по 30 мл, заражают комочком навоза или свежей почвы и ставят в термостат при температуре 28⁰С на 3-5 суток. Под пробку колбы подвешивают полоску красной лакмусовой бумажки для обнаружения выделяющегося аммиака. Для герметичности пробку накрывают целлофановым колпачком, закрепляя его резиновым колечком.

Выделение аммиака обнаруживают по запаху и посинению лакмусовой бумаги. Накопление аммиака в среде проверяют реактивом Несслера.

Для изучения уробактерий из пленки на поверхности среды готовят мазок, фиксируют, окрашивают фуксином и микроскопируют. Обнаруженные виды зарисовывают.

2 Контрольные вопросы

1) Какие микроорганизмы являются возбудителями процесса аммонификации белка и мочевины?

2) С помощью каких качественных реакций можно обнаружить присутствие в среде аммиака, сероводорода?

Лабораторная работа №13

⇐ Предыдущая 1 2 345 Следующая ⇒