ПРАВИЛА РАБОТЫ И ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Кафедра ботаники, физиологии и

селекции растений

ОПД.Ф.09 МИКРОБИОЛОГИЯ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к выполнению лабораторных работ

Специальности:

260202 Технология хлеба, кондитерских и макаронных изделий

260201 Технология хранения и переработки зерна

260204 Технология бродильных производств и виноделие

260501 Технология продуктов общественного питания

Уфа 2012

УДК 579: 378.148

ББК28.4 + 74.58

М54

Рекомендовано к изданию методической комиссией агрономического факультета (протокол № 5 от 17.02.2012 г.)

Составитель: доцент Рахимова Г.М.

Рецензент: доцент кафедры безопасности жизнедеятельности и экологии Мухаметшин З.А.

Ответственный за выпуск: зав. кафедрой ботаники, физиологии и селекции растений доц.Сергеев В.С.

г.Уфа, БГАУ, кафедра ботаники, физиологии и селекции растений

ВВЕДЕНИЕ

Современная микробиологическая лаборатория представляет собой комплекс помещений, оборудования и приборов, позволяющих использовать различные приемы для выращивания бактерий, выделения их чистых культур, изучения морфолого-культуральных, физиолого-биохимических и молекулярных свойств

ПРАВИЛА РАБОТЫ И ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Специфика микробиологической лаборатории требует строгого соблюдения порядка и чистоты. Приступая к лабораторным занятиям по микробиологии, студент занимает место за учебным столом, которое закрепляется за ним на все время занятий. Рабочее место оборудовано всем необходимым для работы. Студент работает с одним и тем же микроскопом и несет за него ответственность.

За каждым студентом закрепляется постоянное место работы и микроскоп.

Перед началом работы необходимо надеть халат, а на голову белый колпачок или косынку.

В лаборатории категорически запрещается принимать пищу. Не допускается лишнее хождение, резкие движения, посторонние разговоры.

Никаких лишних предметов, не имеющих отношение к работе, на столе не должно быть. Стол должен иметь гладкое, химически устойчивое покрытие, которое легко поддается антимикробной обработке. Для протирания поверхности стола можно использовать 1-3%-ный раствор хлорамина, 70-%-ный раствор изопропилового или этилового спирта. Стол необходимо протирать перед началом работы и после ее окончания.

Все предметы, использованные при работе с живыми культурами, должны быть обеззаражены либо обжиганием в пламени горелки (петли, иглы), либо погружены в дезинфицируюший раствор (предметные и покровные стекла, пипетки, шпатели).

В случае попадания исследуемого материала или культуры микроорганизмов на руки, халат или обувь необходимо немедленно сообщить об этом преподавателю и под его контролем провести дезинфекцию. Все открытые части тела обрабатывают дезраствором или 70-%-ным спиртом; слизистые оболочки – 0, 05%-ным раствором перманганата калия, глаза обрабатывают 1%-ным раствором борной кислоты или под струей воды, или вводят в глаза несколько капель 1%-ного раствора нитрата серебра, в нос – 1%-ный раствор протаргола, рот и горло дополнительно прополаскивают 70-%-ным спиртом, или 0, 05%-ным перманганатом калия, или 1%-ным раствором борной кислоты.

Все засеянные пробирки, чашки помещают в термостат или сдают лаборанту. На пробирках, колбах, чашках Петри должна быть сделана надпись, содержащая родовые названия культуры, дату засева, фамилию студента и номер группы.

Отработанный материал (пробирки, чашки Петри) после занятия помещают в определенные емкости по указанию лаборанта для его обеззараживания.

В конце занятия студент должен привести в порядок рабочее место, вымыть руки. Необходимо иметь индивидуальное полотенце, салфетки для вытирания рук.

После окончания работы рабочее место должно быть приведено в полный порядок. Воздух лаборатории продезинфицирован ультрафиолетовыми лучами или простым проветриванием.

Каждый студент должен вести лабораторный журнал, являющийся документом, позволяющим контролировать правильность полученных данных. Записи проводятся в определенной последовательности и должны содержать следующее:

1) номер работы, ее название, дату постановки и окончания опыта;

2) объект исследования;

3) условия проведения опыта, включая методы анализов;

4) полученные результаты и выводы из них.

При изучении морфологии культур делаются их зарисовки при определенных увеличениях микроскопа, что указывается в тетради; цифровые данные обобщают в таблицах, графиках, диаграммах.

Лабораторная работа №1

Морфология бактерий

1.1 Цель работы: научиться готовить прижизненные и фиксированные препараты конкретных штаммов бактерий; ознакомиться с многообразием форм микроорганизмов.

Задание

1. Приготовить постоянные препараты из культур родов Micrococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Sarcina. Просмотреть препараты с иммерсией и сделать зарисовки.

2. Приготовить фиксированные препараты палочковидных бактерий (Bacillus cereus, Bacillus subtilis и др). Просмотреть препараты с иммерсией и сделать зарисовки. Отметить форму окончаний клеток, их взаимное расположение.

3. Приготовить постоянные препараты из зубного налета. Спириллы и спирохеты плохо воспринимают красители, поэтому после фиксации мазка в пламени горелки проводят его обработку в течение 3-5-мин. 0, 5% раствором соляной кислоты. Протравливание клеток в соляной кислоте повышает их восприимчивость к красителю. Мазок окрашивают в течение 1-2 мин. фуксином Циля. Исследовать препарат и зарисовать все встречающиеся формы бактерий.

4. Ответить на контрольные вопросы.

Приборы, посуда, реактивы.

Микроскоп и осветитель; микробиологическая петля; предметные стекла обезжиренные; покровные стекла; стерильные пипетки на 1-2мл; капельница с водой; хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага; спиртовка; красители (метиленовый синий (1: 10), фуксин Циля), 0, 5% раствор соляной кислоты, капельница с 96% спиртом, иммерсионное масло, культуры микроорганизмов; дезинфицирующий раствор.

Морфологическая характеристика микроорганизмов включает форму клеток, их сочетание и размеры, подвижность, способность к образованию спор и капсул, наличие в клетках определенных включений.

При описании морфологии клеток следует указывать возраст культуры, состав среды и условия культивирования.

Известны 4 основных формы бактерий: шаровидная (сферическая), палочковидная, извитая и нитевидная

Шаровидные бактерии. Бактерии, имеющие шаровидную форму, различаются по сочетанию клеток. Бактерии, клетки которых встречаются в виде одиночных шариков, получили название кокков или микрококков (Micrococcus), соединенные по две - называются диплококками (Diplococcus), соединенные в более длинные цепочки – стрептококками (Streptococcus). Те формы, у которых наблюдается соединение клеток, напоминающее виноград, называются стафилококками (Staphylococcus). Сочетания по четыре кокка – тетракокки (Tetracoccus) – возникают при делении клеток в 3-х взаимно перпендикуллярных направлениях и, при этом наблюдается образование пакетов по восемь и больше клеток. Такие бактерии называются сарцинами (Sarcyna).

Шаровидные бактерии не всегда имеют форму шара. Так, например, у стрептококков в цепочке встречаются сплющенные клетки, приближающиеся по форме к короткой палочке, а у Diplococcus lanceolatis клетки заострены с одной стороны, сходны по форме с окончанием ланцета и др.

Палочковидные бактерии. Бактерии, имеющие форму палочек, отличаются между собой размерами, отношением длины клеток к ширине, окончанием клеток. Концы клеток бывают заостренные, тупые, закругленные и др. Палочковидные бактерии, образующие в определенных условиях споры, называются Bacillus. К ним относятся наиболее крупные из палочковидных форм, длина которых превышает ширину более чем в 2-3 раза. Не образующие споры палочковидные формы называются бактериями в узком смысле слова (Bacterium). Палочковидные бактерии, как и шаровидные формы, могут соединяться по две клетки (Diplobacterium) и в цепочки (Streptobacterium, Streptobacillus).

Извитые бактерии. Извитые бактерии различаются по количеству и величине их завитков. Слегка изогнутые палочки, у которых всего один изгиб, не превышающий ¼ оборота спирали, называются вибрионами (Vibrio).

Бактерии, имеющие один или несколько правильных завитков, относятся к спириллам (Spirullum). Тонкие извитые формы, имеющие много завитков, называются спирохетами.(Spirochetae).

Бактерии нитевидной формы. Бактерии нитевидной формы представляют собой нити из цилиндрических и дисковидных клеток, часто окруженных общим чехлом. Длина нитей может достигать 500 мкм, они могут быть как прямыми, так и скрученными в спирали, у некоторых форм нити плоские, похожи на ленты. Это многоклеточные коллониальные организмы, не имеющие функционального разделения между клетками.

2 Контрольные вопросы

1) Какие признаки микроорганизмов относятся к морфологическим?

2) Перечислите основные формы бактерий и дайте им характеристику

Лабораторная работа № 2

1 Окраска бактерий по Граму

1.1 Цель работы - овладеть цитохимическими методами исследования строения клеток микроорганизмов, так как особенности ультраструктуры бактериальной клетки имеют важное значение при их идентификации.

Задание

1. Приготовить препарат из трех культур:

- грамположительной

- грамотрицательной

- свежевыделенной неопределенной культуры

2. Произвести окраску по Граму.

3. Промикроскопировать и зарисовать микроорганизмы.

4. Протестировать вновь определенную культуру экспресс-методом и убедиться в правильности проведенного анализа.

Приборы, посуда, реактивы

Микроскоп и осветитель; микробиологическая петля; предметные стекла обезжиренные; покровные стекла; стерильные пипетки на 1-2 мл; капельница с водой; хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага; спиртовка; красители (карболовый генциановый фиолетовый; водный фуксин Пфейффера, раствор Люголя); 3%-й раствором KOH, капельница с 96% спиртом, иммерсионное масло, культуры микроорганизмов; дезинфицирующий раствор.

Ход работы Окраска клеток бактерий по Грамму. Для дифференциации микробных клеток, различающихся химическим составом и структурой клеточных стенок, используется сложный метод окраски – окраска по Граму (по имени датского ученого).

По отношению к окраске по Граму все бактерии можно разделить на две группы: грамотрицательные и грамположительные. Грамотрицательные бактерии после последовательной обработки препарата раствором йода и генциановым фиолетовым легко обесцвечиваются спиртом, тогда как грамположительные - более прочно удерживают темно-фиолетовую окраску.

Способность клеток окрашиваться по Граму обусловлена химическим составом оболочки и иногда зависит от возраста культуры. Поэтому красить

по Граму следует клетки молодых (односуточных) культур.

Окраску по Граму осуществляют следующим образом:

1. Готовят на предметном стекле три мазка культуры микроорганизмов: в центре – мазок исследуемой культуры, слева и справа – мазки контрольных микроорганизмов.

Мазки должны быть тонкими, чтобы клетки равномерно были распределены по поверхности стекла и не образовывали скоплений, так как от толщины мазка могут зависеть результаты окрашивания.

Высушивают мазки на воздухе, фиксируют над пламенем горелки.

2. Окрашивают мазки карболовым генциановым фиолетовым. На мазки наносят достаточное количество красителя, выдерживают 1-2 мин., краситель сливают и, не смывая водой, мазки обрабатывают раствором Люголя до почернения (приблизительно 1-2 мин)

3. Сливают раствор Люголя и обрабатывают препарат 0, 5-1 мин. (строго) 96%-ным этиловым спиртом, или путем погружения в стаканчик со спиртом, или путем нанесения спирта на мазок (от времени обработки мазка спиртом зависит результат всего окрашивания: при недостаточной обработке все бактерии сохраняют окрашивание, при чрезмерной – обесцвечиваются).

4. Препарат немедленно промывают водой и окрашивают его 1-2 мин. водным фуксином. Сливают краситель, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.

5.Микроскопируют препарат с иммерсионной системой. Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный или розовый цвет фуксина (цвет дополнительного красителя).

Экспресс-метод определения грам-типа микроорганизмов

Грам-тип микроорганизмов можно определять и быстрым экспресс-методом.

Метод основан на разрушении клеток грамотрицательных бактерий в щелочной среде и определении свободной ДНК.

На предметное стекло наносят каплю 3%-ного раствора KOH, в которую вносят бактериальной петлей исследуемые бактерии (24-часовая культура со скошенного агара) и хорошо перемешивают петлей.

Через 5-10 сек. при передвижении петли по стеклу при продолжительной реакции в результате тестирования грамотрицательных бактерий образуется слизистый след длиной 1-2 см. Если слизь не образуется, то реакция отрицательная, тогда тестируется грамположительная культура.

2 Контрольные вопросы.

1 ) Химический строение какого компонента клеточной стенки бактерий положено в основу деления их на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы?

2) Почему грамотрицательные микроорганизмы после обработки их 3%-ным раствором KOH оставляют на стекле слизистый след?

3) Какой признак положен в основу классификации бактерий?

Лабораторная работа № 3

1 Методы выявления капсул и спор

1.1 Цель работы: познакомиться с методикой выявления бактерий, обладающих способностью образовывать споры и капсулы.

1.2 Задание

1. Приготовить и просмотреть прижизненные и постоянные препараты культур родов Bactillus, Clostridium.

2. Приготовить постоянные препараты этих же культур с окраской спор по методу Ожешке. Просмотреть препараты с иммерсией и сделать зарисовки.

3. Произвести негативную окраску капсул у культуры рода Azotobacter.

4.Просмотреть препараты и сделать зарисовки.

1.3 Приборы, посуда, реактивы.

Микроскоп и осветитель; микробиологическая петля; предметные стекла обезжиренные; покровные стекла; стерильные пипетки на 1-2мл; капельница с водой; хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага; спиртовка; красители (метиленовый синий (1: 40), карболовый фуксин Циля); 0, 5%-ный раствор туши, 1%-ный раствор серной кислоты, 0, 5%-м раствор HCl, капельница с 96% спиртом, иммерсионное масло, культуры микроорганизмов; дезинфицирующий раствор.

Ход работы Выявление капсул

Клетки многих микроорганизмов, особенно при росте их на средах, богатых углеводами, могут быть окружены рыхлым внешним слоем – капсулой или слизью. Эти структуры часто имеют консистенцию геля и плохо видны при микроскопировании живых клеток. Химический состав капсул у многих бактерий неодинаков, поэтому их нельзя выявить каким-либо одним методом окраски. Кроме того, капсулы при окраске легко деформируются, а вещество капсулы слабо фиксирует краситель, который легко отмывается в процессе обработки препарата. Чаше всего для выявления капсул применяют способ «негативной» окраски (негативного контрастирования) с помощью жидкой туши. Для этого небольшое количество клеток с плотной среды помещают в каплю разбавленного фуксина, смешивают с каплей туши, закрывают покровным стеклом и просматривают с объективом 40х. При этом на общем фоне препарата хорошо видны бесцветные капсулы, окружающие клетки микроорганизмов, окрашенные в розовый цвет.

Выявление спор.

У некоторых бактерий, чаще всего у палочковидных форм, в определенный период их развития внутри клетки появляется спора. Это округлой или овальной формы тельце, сильно преломляющее свет. В бактериальной клетке обычно образуется одна спора. Различают 3 типа спорообразования: бациллярный, клостридиальный, плектридиальный.

Споры можно обнаружить при наблюдении живых клеток или дифференциальным окрашиванием цитоплазмы.

Так как спора характеризуется более высоким показателем преломления света, в светлом поле они видны как более темные включения округлой или овальной формы.

Дифференциальная окраска протоплазмы и споры основана на слабой проницаемости оболочки споры для молекул основных красителей. Поэтому при простом окрашивании клеток фуксином или генциановым фиолетовым споры не окрашиваются и обнаруживаются в окрашенной цитоплазме в виде бесцветных включений.

Способы окраски спор основаны на том, что первоначально сильным красителем с прогреванием красят одновременно клетку и спору, затем протоплазму обесцвечивают, оставляя спору окрашенной.

После этого протоплазму красят дополнительно в другой контрастный цвет.

Метод окраски спор по Ожешке осуществляется следующим образом:

1) приготовить тонкий мазок на обезжиренном стекле;

2) высушить на воздухе;

3) залить 0, 5%-м раствором HCl и подогреть в течение 2 мин. до появления паров;

4) препарат промыть водой, мазок закрыть фильтровальной бумагой и залить карболовым фуксином Циля;

5) окрашивать в течение 5 мин. при нагревании над пламенем горелки до появления паров. По мере испарения периодически добавлять краситель;

6) препарат вновь промывают водой и обрабатывают в течение 2 мин. 1%-ным раствором H₂SO₄ до обесцвечивания;

7) препарат промывают водой и докрашивают раствором метиленового синего (1: 40) в течение 10-20 минут;

8) краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией.

Бактериальная клетка синяя, а спора – красная.

2 Контрольные вопросы

1) На каких свойствах капсул основаны способы их выявления?

2) Назовите бактерии, образующие капсулы.

3) Какие типы спорообразования различают у бактерий?

4) Способы выявления спор.

5) На чем основаны способы окраски спор?

6) Охарактеризуйте основные стадии процесса спорообразования

7) Какие функции выполняют эндоспоры бактерий и какие споры грибов?

8) Чем объясняется термоустойчивость бактерий?

Лабораторная работа № 4

1 Выявление внутриклеточных включений - полисахаридов, волютина и липидных гранул

1.1 Цель работы - овладение методами выявления внутриклеточных включений микроорганизмов.

Задание

1. Приготовить препарат бактериальной культуры и произвести окраску полисахаридов (гликогена у дрожжей рода Saccharomyces и бактерий рода Bacillus; гранулезы - у бактерий рода Clostridium). Промикроскопировать и сделать зарисовки.

2. Приготовить препарат культуры дрожжей рода Saccharomyces. Произвести окраску жира. Промикроскопировать и сделать зарисовки.

3. Приготовить препарат культуры дрожжей рода Saccharomyces и произвести окрашивание метахроматина (волютина). Промикроскопировать и сделать зарисовки.

1.3 Приборы, посуда, реактивы.

Микроскоп и осветитель; микробиологическая петля; предметные стекла обезжиренные; покровные стекла; стерильные пипетки на 1-2мл; капельница с водой; хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага; спиртовка; красители (метиленовый синий (1: 40, 1: 10, ), карболовый фуксин Циля, судан 3, судан черный, водный фуксин, раствор Люголя); 1%-ный раствор серной кислоты, 5% растворы соляной кислоты, капельница с 96% спиртом, иммерсионное масло, культуры микроорганизмов, дезинфицирующий раствор.

В процессе жизнедеятельности микроорганизмов в цитоплазме клеток могут формироваться морфологические образования, представляющие собой либо продукты обмена клетки, либо запасные питательные вещества. Включения различны по своей природе. У многих микроорганизмов в клетках накапливаются запасные вещества. Это могут быть жироподобные вещества, полисахариды (гликоген, крахмал, гранулеза), серополифосфаты (волютин), кристаллы щавелевой кислоты и др. Они не являются постоянными компонентами клетки, они образуются в зависимости от условий культивирования, возраста культуры и могут использоваться в метаболизме клетки. Эти соединения выявляются с помощью микрохимических реакций.

Ход работы Выявление гранул углеводной природы (гликогена и гранулезы)

Полисахариды выявляют при обработке раствором Люголя.

1. К капле суспензии клеток на предметном стекле добавляют каплю раствора Люголя, выдерживают 10-15 мин. при комнатной температуре.

2. Препарат покрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости и микроскопируют с сухой системой, либо с иммерсией.

Гранулы крахмалоподобных веществ – гранулезы – окрашиваются в синий, а гранулы гликогеноподобных полисахаридов - в красновато-коричневый цвет. Гликоген при окраске раствором Люголя легко выявляется у дрожжей, гранулеза - характерна для бактерий рода Clostridium. Реакция на гликоген хорошо идет только в кислой среде, поэтому перед выявлением в клетках гликогена среду, в которой выращивали микроорганизмы, подкисляют, либо на предметное стекло с каплей воды наносят каплю 0, 5%-ного раствора HCl и в ней эмульгируют исследуемую культуру.

Ход работы Выявление липидных гранул

У дрожжей и мицелиальных грибов запасные липиды представлены нейтральными жирами, которые легко обнаруживаются в живых клетках без специальных методов окраски в виде сильнопреломляющих свет капель. Бактерии в качестве резервных липидов образуют поли-β -оксимасляную кислоту. Гранулы поли-β -оксибутирата хорошо заметны при микроскопировании живых бактериальных клеток с фазово-контрастным устройством, однако чаще для их выявления клетки окрашивают липофильным красителем – суданом 3 или суданом черным.

1. Наносят каплю густой микробной взвеси на предметное стекло. Добавляют каплю формалина (40%-ного), либо 5%-ный раствор HCl и выдерживают 5 мин. (формалин убивает клетку и разрыхляет ее оболочку)

2. Добавляют каплю метиленового синего (1: 10, либо 1: 40) и выдерживают 10 мин.

3. Добавляют каплю концентрированного раствора судана 3 в 90%-ном этаноле и выдерживают 5 мин. Накрывают покровным стеклом.

Микроскопируют с сухой или иммерсионной системой.

Клетки окрашены в синий, включения жира – в розово-оранжевый цвет.

Ход работы Выявление полифосфатов (волютина) по Омелянскому

В клетках прокариот волютин локализован в цитоплазме, в клетках эукариот – в вакуолях. Окраска волютиновых гранул основана на свойствах метахромазии – способности вызывать изменение цвета некоторых красителей (метиленовый синий, толуидиновый синий).

1. Готовят тонкий мазок клеток, высушивают его на воздухе и фиксируют в пламени горелки. На фиксированный мазок наливают карболовый фуксин Циля на 0, 5-1, 0 мин.

2. Краситель сливают, препарат промывают водой и обесцвечивают 20-30сек. 1%-ным раствором серной кислоты. Сливают кислоту, промывают препарат водой и дополнительно окрашивают метиленовым синим (1: 40) в течение 1-2 мин. Промывают препарат водой, высушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют с иммерсионной системой. При этом цитоплазма окрашивается в голубой цвет, а зерна волютина – в фиолетово-красный.

2 Контрольные вопросы

1) Какие структуры бактериальной клетки можно отнести к поверхностным, а какие к внутриклеточным?

2)Чем отличаются прокариоты от эукариот?

Лабораторная работа № 5

1 Морфология актиномицетов и микроскопических грибов

1.1 Цель работы – ознакомиться с особенностями строения актиномицетов и микроскопических грибов, способами размножения и основными представителями

Задание

1. Рассмотреть препарат актиномицетов при малом увеличении непосредственно на чашках Петри. Отметить характер роста, цвет колоний края колоний, форму спороносца.

2. Приготовить препарат культуры актиномицетов методом «отпечаток». Просмотреть при увеличении 8x и 40x, зарисовать воздушный и субстратный мицелий, споры актиномицетов.

3. Познакомиться с ростом грибов рода Mucor, Aspergillus, Penicillium на чашках Петри при малом увеличении. Приготовить препараты на предметных стеклах, зарисовать гифы воздушного и субстратного мицелия, спорангии с эндоспорами, конидиеносцы с конидиями.

4. Приготовить препараты дрожжей рода Saccaromyces, выявить делящиеся клетки, описать способы деления; зарисовать

5.Приготовить препараты аспорогенных дрожжей родов Candida, Rhodotorulla; зарисовать почкующиеся клетки, псевдомицелий и бластоспоры.

6. Приготовить препараты мицелиальных дейтеромицетов рода Fusarium, Oidium. Зарисовать мицелий, конидии и оидии.

Приборы, посуда, реактивы.

Микроскоп и осветитель; микробиологическая петля; препаровальные иглы; предметные стекла обезжиренные; покровные стекла; капельница с водой; хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага; спиртовка; иммерсионное масло, метиленовая синь (1: 40); культуры микроорганизмов, дезинфицирующий раствор.

Актиномицеты - лучистые грибы. Эта группа микроорганизмов занимает промежуточное положение между бактериями и грибами, поэтому их и называют грибобактериями или лучистыми грибами. Они одноклеточные, как бактерии, и образуют мицелий, как грибы. Диаметр нитей у этих микроорганизмов очень мал, как у бактерий (0, 5 - 0, 8 мкм) гифы мицелия длинные и ветвистые, как у грибов. С грибами их объединяет также способность размножаться спорами. На питательных средах актиномицеты образуют пушистые, бархатистые, мучнистые, преимущественно плотные кожистые колонии, срастающиеся с субстратом, иногда они имеют характерный землистый запах. Многие представители актиномицетов продуцируют пигменты, поэтому их воздушный мицелий и особенно колонии окрашены в различные цвета.

Чтобы выявить характерные морфологические признаки колонии актиномицетов, сначала следует рассматриватьих при малом увеличении непосредственно на питательной среде на чашках Петри или по краю колонии в пробирке. При этом можно видеть, что гифы мицелия частично внедряются в субстрат, частично стелются по поверхности и приподнимаются над ней. На концах нитей воздушного мицелия хорошо просматриваются спороносцы со спорами. Спороносцы по строению бывают прямые, волнистые, спиральные и мутовчатые. Затем готовят препарат «отпечаток».

Ход работы Приготовления препарата «отпечаток».

1. Чистое покровное стекло накладывают на газон актиномицетов и слегка прижимают к поверхности мицелия.

2. Затем снимают и опускают его в каплю воды или метиленовой сини (1: 40) на предметом стекле вниз той стороной, на которой имеется налет актиномицетов. Знакомятся с формой спор актиномицета.

Грибы. Объектом микробиологии являются и многие виды микроскопических грибов, поэтому с некоторыми их представителями следует познакомиться на практических занятиях.

3 и г о м и ц е т ы - низшие грибы, имеют хорошо развитый ветвистый одноклеточный мицелий. Размножаются половым путем и бесполым, т.е. при помощи спор. Представитель класса - мукор (Mucor mucedo) развивается в виде войлоковидного белого или серого налета на продуктах растительного происхождения, навозотравоядных животных.

а б

Рис.1 Микроскопические грибы: a)Aspergillus, б)Penicillium.,

1-вегетативный мицелий, 2-конидиофор, 3-стеригмы, 4-конидии

Мицелий мукоровых грибов пронизывает субстрат и частично стелется по его поверхности. Вверх от него отходят особые воздушные гифы - спорангиеносцы, вздувающиеся на концах. Эти вздутия (спорангии) в дальнейшем отделяются от спорангиеносцев перегородкой, и в них бесполым путем образуются многочисленные спорангиоспоры - эндоспоры ( лат. Endo – внутренние).

Перегородка, отделяющая спорангий от спорангионосца, внутри спорангия проходит куполообразно, поэтому верхняя часть спорангионосца оказывается внутри спорангия. Этот участок спорангионосца называется колонкой и у разных видов мукоровых грибов имеет различную форму (грушевидную, шаровидную, цилиндрическую).

Ход работы Порядок приготовления препарата

1. Для просмотра следует осторожно взять препаровальной иглой небольшое количество мицелия и другой препаровальной иглой снять его на сухое предметное стекло. Препарат сначала рассматривают без покровного стекла при малом увеличении микроскопа. Видны спорагионосцы и круглые темные шарики на их концах - спорангии. Обычно они покрыты тонкими шипами из кристаллов оксалата кальция.

2. Затем на поверхность препарата наносят каплю воды, накрывают его покровным стеклом. Оболочка спорангия при этом разрушается, и споры вываливаются. Рассматривают последовательно при малом и большом увеличениях (без иммерсии).

А с к о м и ц е т (сумчатые грибы) - высшие грибы с многоклеточным или частичным мицелием, образующие споры в сумках - асках. Они включают представителей эуаскомицетов (истинных аскомицетов), у которых сумки со спорами образуются в результате полового процесса на поверхности или внутри плодовых тел, образуемых сплетением гиф мицелия (возможно и бесполое размножение экзогеннс образующимися спорами – конидиями), и гемиаскомицетов, у которых плодовые тела отсутствуют. К гемиаскомицетам относится большинство дрожжей, которые мы рассмотрим отдельно.

Эуаскомицеты включают два важнейших рода почвенных грибов Penicillium и Aspergillus, которые нередко называются также плесневыми грибами. К группе плесневых грибов относятся и некоторые представители зигомицетов и несовершенных грибов. Пенициллы и аспергиллы имеют хорошо развитый многоклеточный мицелий. Размножаются преимущественно конидиальным спороношением. Грибы рода Penicilliurn (рис.1) называются кистевиками, так как они образуют конидии на концах мутовчаторазветвленных конидиеносцев, напоминающих кисть руки. Иногда отдельный пучок конидиеносцев, выходящих как бы из одной точки и отчленяющих кондии, напоминают рисовальные кисти.

Ход работы Порядок приготовления препарата

1.При просмотре строения конидиеносцев Penicillium glaucum препаровальной иглой вырезают кусочек мицелия (примерно 0, 5 мм²) на границе между его зеленым и белым участками.

2.Осторожно с помощью двух препаровальных игл снимают со среды и помещают в каплю воды на предметное стекло.

3.Сверху на мицелий кладут покровное стекло. Поскольку мицелиальная пленка гриба довольно толстая, может получиться так, что под покровным стеклом вода не целиком окружает исследуемый мицелий. В этом случае надо из капельницы добавлять воду под покровное стекло до тех пор, пока кусочек мицелия не будет со всех сторон окружен водой.

4.Стеклянной палочкой (или препаровальной иглой) на покровное стекло слегка надавливают в центре. Избыток воды можно удалить фильтровальной бумагой. Препарат сначала просматривают при малом увеличении, уделяя основное внимание его краям, так как на них обычно хорошо видны кисти конидиеносцев. Когда подходящий участок найден, переводят с объектива 8х на 40х и детально рассматривают кисточки. Во время просмотра при малом увеличении конденсор несколько опускают, при переводе на объектив 40х снова регулируют освещенность поднятием конденсора.

Aspergillus, или леечная плесень, имеет обычно одноклеточные конидиеносцы шаровидно, булавовидно или грушевидно вздутые. На них располагаются параллельно друг другу короткие кеглеобразные стеригмы, каждая из которых отшнуровывает радиально цепочки конидий. Некоторые виды аспергиллов имеют два ряда стеригм. Вся головка конидиеносца с радиально расходящимися цепочками конидий напоминает наконечник лейки со струйками воды. Для ознакомления со строением конидиеносца аспергилла препаровальной иглой берут небольшое количество мицелия на границе между черным и коричнево-бурым участком и вносят в каплю воды на предметное стекло. Далее поступают так, как и при просмотре пеницилла.

Строение мицелия и органов бесполого размножения можно изучать в колониях грибов, выращенных на плотной питательной среде. Для этого культуры грибов микроскопируют непосредственно на чашках или в пробирках при малом увеличении.

Д р о ж ж и. По современным представлениям, дрожжи – это сборная группа одноклеточных микроскопических микроорганизмов, относящихся к разным классам грибов. Преимущественно они относятся к классу аскомицетов. Диаметр клеток дрожжей колеблется от 8 до 15 мкм. Форма их разнообразная: эллипсовидная, грушевидная, округлая, цилиндрическая. Размножаются вегетативным и половым путем. Вегетативные способы размножения – почкование и деление, половой связан с образованием спор. Для лабораторных занятий могут быть использованы пивные дрожжи.

Ход работы Порядок приготовления препарата для просмотра

Небольшой кусочек дрожжевой массы помещают за несколько часов до занятий в теплую подсахаренную воду и ставят в теплое место. Образуется беловатая мутная жидкость.

На предметное стекло наносят каплю жидкости, закрывают покровным стеклом, наносят на него кедровое масло и просматривают препарат с иммерсионной системой.

В пекарских дрожжах обычно присутствует две расы дрожжей: одна представлена округло-эллипсовидными клетками, быстро разъединяющимися при почковании: другая - удлиненно-цилиндрическими, образующими при почковании ветвистые кустики (псевдомицелий). На многих клетках видны почки. В мелкозернистом содержимом живых дрожжей хорошо заметны крупные прозрачные вакуоли, занимающие иногда центральное положение.

2 Контрольные вопросы

1). Какие признаки положены в основу классификации грибов?

2) Назовите основные способы размножения грибов.

3) Почему дрожжи относят к разным таксономическим группам грибов?

Лабораторная работа № 6

1 Приготовление питательных сред и посуды для культивирования микроорганизмов.

1.1 Цель работы: познакомиться с методами стерилизации питательных сред и посуды; разнообразием сред для культивирования микроорганизмов.

1.2 Задание (для каждого студента)

1. Приготовить 50 мл МПА добавлением к МПБ до 1, 5% агар-агара, расплавить и разлить в 3 большие пробирки

2. В 5 маленьких пробирок налить по 9 мл водопроводной воды.

3.В колбу налить 100 мл водопроводной воды.

4. Завернуть для сухой стерилизации по 3 чашки Петри и по 2 пипетки и подписать.

5. Приготовить ватные пробки, закрыть ими пробирки и колбу, все подписать и отдать на стерилизацию.

Приборы, посуда, реактивы.

Чашки Петри, пробирки, пипетки, вата, бумага для заворачивания посуды; мясной бульон, пептон, NaCl, сушильный шкаф, автоклав.

Для выращивания микроорганизмов применяют разнообразные по составу питательные среды. К числу широко используемых относятся среды, которые готовят на основе мясо-пептонного бульона (МПБ) и (или) ячменного сусла. Эта так называемые натуральные среды. На этих средах растут многие микроорганизмы, так как в них имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста. Кроме натуральных широко используют полусинтетические и синтетические среды, которые наряду с соединениями известной химической природы содержат вещества неопределенного состава.

12 3 4 5 Следующая ⇒