Маслянокислое брожение. Брожение пектиновых веществ

1 Маслянокислое брожение

1.1 Цель работы изучить возбудителей и продукты маслянокислого брожения.

Задание

1. Получить накопительную культуру анаэробных маслянокислых бактерий. Приготовить препарат «раздавленная капля». Микроскопировать с объективами 20х и 40х.

2. Провести качественные реакции на масляную кислоту.

1.3 Приборы, посуда, реактивы. Большие пробирки, резиновые пробки к ним, клубни картофеля, мел в порошке, водяная баня, раствор Люголя, 5%-ный раствор хлорида железа (FeCL₃)₎, микроскопы, красители.

Маслянокислое брожение - это сложный процесс превращения углеводов в масляную кислоту и другие продукты, совершаемый группой анаэробных спорообразующих бактерий. Схематично процесс может быть изображен в следующем виде:

C₆H₁₂O₆ → CH₃CH₂CH₂COOH+2CO₂+2H₂+495 кДж

Процессу маслянокислого брожения подвергаются не только простые углеводы, но и полисахариды (крахмал, декстрин и др.), органические кислоты, спирты и белки. Поэтому по характеру используемых субстратов маслянокислые бактерии делятся на две группы:

1)Сахаролитические – расщепляют сахара и полисахариды;

2)Пептолитические – расщепляют белки, пептоны и аминокислоты.

Типичным представителем маслянокислых бактерий, осуществляющих маслянокислое брожение, является Clostridium butiricum –крупная палочка (1-2х10 мм). Молодые клетки этих бактерий имеют палочковидную форму, далее в клетках отлагается гранулеза (полисахарид), они утолщаются, сохраняя палочковидную форму, а затем становятся веретоновидными (клостридиальными). Гранулеза постепенно исчезает, в одном из концов клеток формируются споры. Клетки спорообразующих анаэробов грам-положительны, подвижны (характеризуются перитрихиальным расположением жгутиков). Бактерии – облигатные анаэробы, кислород токсичен для их вегетативных клеток, однако споры могут переносить аэробные условия. Клетки клостридий не содержат цитохромов, они лишены каталазы, но имеют большое количество флавиновых ферментов, которые способны переносить водород от субстрата на свободный кислород с образованием перекиси водорода,

Субстрат + O₂ → окисленный субстрат + H₂O₂

В отсутствие каталазы перекись водорода аккумулируется в бактериальных клетках в летальных концентрациях.

В природе маслянокислое брожение имеет большое значение как звено в цепи превращений соединений углерода. В то же время в ряде производств народного хозяйства маслянокислые бактерии могут наносить значительный ущерб, вызывая вспучивание сыров, прогоркание молока, порчу консервов, силоса, овощей, картофеля и других продуктов.

Вместе с тем масляная кислота требуется для некоторых промышленных целей и ее получают на заводах, сбраживая специально приготовленные заторы чистой культурой маслянокислых бактерий. Образовавшуюся кислоту затем отделяют и очищают химическим путем.

Ход работы. Для изучения маслянокислого брожения опыт ставят на среде с картофелем. Сырой очищенный картофель нарезают мелкими кубиками, заполняют ими 1/3 высокой пробирки, добавляют немного мела (для нейтрализации масляной кислоты), заливают водопроводной водой на 2/3 и помещают в водяную баню при температуре 80⁰С на 10 минут (для пастеризации). В среду не вносят ни почвы, ни маслянокислых бактерий, так как на кожуре картофеля их споры всегда имеются.

Через 2-3 дня картофель всплывает наверх вследствие бурно идущего газообразования.

По окончании брожения через 5-7 дней культуральную жидкость используют для микроскопирования маслянокислых бактерий и качественного определения продуктов брожения. При микроскопировании обнаруживают подвижные палочки с закругленными концами, одиночные и парные, грамположительные, споры клостридиального типа.

При микроскопировании можно добавить к культурной жидкости на предметном стекле каплю раствора Люголя. Маслянокислые бактерии содержат в своих клетках гранулезу, которая окрашивается раствором Люголя в синий цвет. С культурной жидкостью проводят качественную реакцию на масляную кислоту. Для этого к 5 мл жидкости добавляют 2 мл 5 %-ного раствора хлорида железа. При нагревании образуется маслянокислое железо коричневого цвета.

2 Брожение пектиновых веществ

2.1 Цель работы - изучить возбудителей и продукты брожения пектиновых веществ.

2.2 Задание.

1. Отразить результаты микроскопического изучения возбудителей пектинового брожения и проведения качественной реакции на масляную кислоту.

2.3 Приборы, посуда, реактивы: стебли льна или крапивы, большие пробирки, микроскопы, красители, раствор Люголя (реактив на гранулезу) 5%-ный раствор хлорида железа (FeCL₃).

Пектины представляют собой полигалактурониды – неразветвленные цепи, состоящие из остатков Д-галактурновых кислот, соединенных α -1, 4 –гликозидными связями. Это растительный материал, склеивающий клетки в ткани. Способность расщеплять пектин присуща многим грибам, бактериям и актиномицетам с помощью пектолитических ферментов – эстераз и деполимераз. Пектинэстеразы разрывают эфирные связи, в результате чего высвобождаются метанол и полигалактуроновые кислоты. Последние в свою очередь расщепляются гидролазами – полигалактуронилазами до олигомеров и мономеров Д-галактуроновой кислоты. Образующиеся углеводы в анаэробных условиях сбраживаются по типу маслянокислого брожения. Наиболее активно сбраживают пектиновые вещества бактерии Clostr.pectinovorum и Cl.feltsineum. В естественных условиях процесс росяной мочки прядильных растений идет благодаря деятельности аэробных микроорганизмов рода Bacillus и плесневых грибов: Mucor, Cladosporium, Alternaria. Разрушаются пектиновые вещества медленно в течении 3-8 недель.

Ход работы. Для изучения брожения пектиновых веществ ставят следующий опыт. Снопик льняной соломы высотой 6-7 см перевязывают в двух местах ниткой и вносят в пробирку (лучше большого размера, чем в стандартные). Пробирки наполняют на 2/3 водопроводной водой, зажимают пинцетом и кипятят на горелке 2-3 минуты для удаления экстрактивных (легкосбраживаемых) веществ, которые могут служить источником углерода для других маслянокислых бактерий. Вода приобретает желтовато-зеленый цвет. Ее сливают. Вновь наполнив пробирку водопроводной водой, ее вторично кипятят несколько минут и снова сливают. Это повторяют 5-6 раз. После последнего кипячения жидкость не сливают. Охлаждают ее под краном и вводят свежий стебель, не подвергавшийся нагреванию с целью внесения возбудителей брожения.

Пробирку со снопиком ставят в термостат при температуре 35-37⁰С. Через 2-3 дня в ней начинается брожение, а через 5-8 дней оно заканчивается.

1) Микроскопирование возбудителей брожения пектиновых веществ Извлекают снопик из пробирки, берут несколько соломинок из центра снопика и отжимают из одного их конца немного жидкости на предметное стекло. Добавляют каплю раствора Люголя, накрывают покровным стеклом и микроскопируют с иммерсионной системой. На препарате обычно выявляются крупные палочковидные бактерии с плектридиальным типом спорообразования (барабанная палочка) и прерывчатым расположением гранулезы, окрашенной в синий цвет. Это Clostridium pectinovorum.

Не редко на препарате обнаруживается Cl.felsineum., палочки меньшего размера, сигарообразной формы, со спорой на конце. Гранулеза может заполнить всю вегетативную часть клетки.

2) Проведение качественной реакции на масляную кислоту. Накопление в культуральной жидкости масляной кислоты (наряду с уксусной кислотой, возникающей при гидролизе пектина) можно обнаружить с помощью качественной реакции, которая описана в предыдущей работе.

2 Контрольные вопросы

1) Какие микроорганизмы являются возбудителями маслянокислого брожения?

2) Какие метаболиты являются акцепторами водорода от восстановленных дегидрогеназ при молочнокислом и маслянокислом брожениях?

3) Какие микроорганизмы являются возбудителями пектинового брожения?

Лабораторная работа № 11

⇐ Предыдущая 1 234 5 Следующая ⇒