Микробиологические методы исследования воздуха, почвы и пищевых продуктов

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 5Следующая ⇒

1.1 Цель работы – ознакомиться с методами исследования объектов окружающей среды (воздуха, почвы, других природных и техногенных сред, пищевых продуктов), которые необходимы при санитарно-гигиенических и экологических исследованиях, при контроле качества окружающей среды, соответствия ее гигиеническим нормативам, обеспечивающим безопасность условий труда и здоровья человека.

Задание.

1. Осуществить посев на МПА микроорганизмов воздуха лабораторных помещений и коридора методом оседания.

2. Осуществить глубинный посев на МПА различных разведений почвы (от 10^-2 до 10^-6г).

3. Осуществить посев пищевых продуктов плотной консистенции на МПА

Приборы, посуда, реактивы.

Стерильная посуда, стерильный МПА, разлитый в пробирки; колбочки со 100 мл стерильной воды; стерильная вода, разлитая в пробирки по 9 мл, 10%-ный стерильный бикарбонат натрия, стерильные пипетки, спиртовка, шпатели, часовые стекла, 96%-ный этиловый спирт; почва, продукты питания.

Посев микроорганизмов воздуха.

В окружающем воздухе содержится масса сапрофитных и патогенных микроорганизмов, попадающих в него с пылью, выдыхаемых при дыхании, кашле разговоре. Для микробиологического исследования воздуха пользуются методами, в основу которых положены оседание (седиментация) и аспирация.

Ход работы Подготовленную чашку Петри развертывают и оставляют в той бумаге, в которой она была стерилизована. Соблюдая стерильность, разогретый МПА разливают в чашки Петри. Для обеспечения стерильности разлив производят около пламени спиртовки в радиусе 10-15 см от ее центра. Горло пробирки обжигают в пламени спиртовки. Свободными пальцами левой руки приоткрывают чашку Петри также в сторону пламени и выливают в нее питательную среду из пробирки. Вращая чашку Петри по поверхности стола, агар равномерно распределяют по дну чашки и дают пластине застыть. На крышке чашки Петри карандашом по стеку указывают вариант опыта, дату посева, фамилию.

Для заражения чашки Петри открывают в исследуемом помещении на 5-20 мин. в зависимости от предполагаемого загрязнения воздуха Крышку чашки Петри снимают и, не переворачивая, ставят рядом. Затем чашку Петри ставят в термостат при 37⁰С.

Посев микроорганизмов почвы.

Почва является наиболее благоприятной средой для развития микроорганизмов. В связи с большой гетерогенностью ее состава, для учета численности микроорганизмов в ней с исследуемого участка берут среднюю почвенную пробу.

Ход работы. Для определения численности бактерий сначала готовят суспензию (методом разведения), содержащую разные концентрации почвы в 1 мл воды. Для этого на стерильное часовое стекло стерильным фарфоровым шпателем или алюминиевой ложкой берут из банки или мешка навеску почвы в 1 г. Часовое стекло, шпатель, ложку обжигают в пламени горелки или фламбируют горящим спиртом. Чтобы при взвешивании почвы в нее не попали бактерии из воздуха, часовое стекло накрывают другим стерильным часовым стеклом.

Навеску почвы, соблюдая условия асептики, переносят в колбу на 250 мл со 100 мл стерильной воды. Смесь взбалтывают 5 минут, не смачивая пробку. Стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии, содержащей 10^{-2 г почвы, и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. Пипетку неоднократно промывают водой в пробирке, чтобы максимально смыть клетки с ее стенки. Другой стерильной пипеткой берут из колбы еще 1 мл суспензии и помещают во вторую колбу, тоже содержащую 100 мл стерильной водопроводной воды. Эту пипетку промывают так же, как и в первом случае. Пробирку и вторую колбу взбалтывают 1 минуту: в пробирке будет концентрация 10-3 г, а во второй колбе – 10-4 г. Точно так же новыми стерильными пипетками переносят по 1 мл суспензии из второй колбы во вторую пробирку с 9 мл и в третью колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды и готовят новые суспензии. Содержащие соответственно в 1 мл 10-5} и 10^{-6 г почвы.}

Для определения численности бактерий в каждом разведении методом питательных пластин можно провести глубинный или поверхностный посев. Последний способ более сложен и занимает больше времени. Для определения живых клеток, содержащихся в 1 мл суспензии каждого разведения, берут 1 мл суспензии из каждого разведения и переносят в стерильную чашку Петри, используя каждый раз новую стерильную пипетку. На крышках чашек Петри карандашом по стеклу отмечают почву, разведение, фамилию студента. Затем в них вливают расплавленный МПА, заранее приготовленный и разлитый по 20 мл в большие пробирки из расчета одна пробирка на одну чашку. Температура агара должна быть примерно 45⁰С. Ее устанавливают следующим образом: пробирку с расплавленным агаром прикладывают к щеке, если щека выдерживает эту температуру, то массу можно выливать в чашку Петри.

Осторожно круговым движением чашки, не смачивая крышку, агар перемешивают с суспензией. Чашки с застывшим агаром переворачивают вверх дном, чтобы избежать попадания на поверхность агара конденсированной воды с крышки, и помещают в термостат при 28-30⁰С.

Клетки микроорганизмов в питательной среде начинают активно размножаться и образуют колонии, видимые невооруженным глазом на пятые сутки.

Посев пищевых продуктов

Порядок взятия проб, методы их исследования и нормативы качества регламентируются серией ГОСТ или другой нормативно-технической документацией.

Исходным материалом для посева продуктов плотной консистенции обычно является 10%-ная взвесь продукта.

Ход работы Для приготовления 10%-ной взвеси продукта взятую из разных мест навеску (обычно около 15 г) измельчают в гомогенизаторе (или растирают в стерильной ступке), прибавляют 136 мл водопроводной воды или изотонического раствора хлорида натрия. Жидкие и полужидкие продукты тщательно перемешивают и в случае резко кислой реакции подщелачивают 10%-ным стерильным бикарбонатом натрия до pH 7, 2-7, 4. Жидкий продукт или полученную взвесь плотного продукта используют для приготовления ряда десятикратных разведений в зависимости от характера продукта и от предполагаемого обсеменения

2 Контрольные вопросы

1) Почему при посеве микроорганизмов почвы готовят несколько разведений?

2) Какая из сред обитания, почва, воздух или вода являются наиболее благоприятной для существования микроорганизмов?

Лабораторная работа № 8

Анализ посевов воздуха, почвы и пищевых продуктов

1.1 Цель работы – провести количественный и качественный учет микрофлоры почвы, воздуха и пищевых продуктов.

Задание

1. Осуществить количественный учет микрофлоры воздуха лабораторных помещений и коридора, подсчитывая число колоний, выросших на МПА, заполнить таблицу 1. Оценить качественный состав микроорганизмов воздуха. Приготовить препараты «раздавленная капля» доминирующих групп микроорганизмов и заполнить таблицы 2 и 3. Микроскопировать и зарисовать.

2. Посчитать общее количество микроорганизмов в 1 г почвы, подсчитывая число колоний, выросших МПА. Описать микробное разнообразие на основании изучения морфологических и культуральных признаков выросших колоний. Заполнить таблицу 2. Приготовить препараты «раздавленная капля» доминирующих групп микроорганизмов. Микроскопировать и зарисовать.

3. Определить общую обсемененность 1 г пищевого продукта, учитывая количество колоний мезофильных микроорганизмов, выросших на мясо-пептонном агаре. Приготовить препараты «раздавленная капля» доминирующих групп микроорганизмов. Микроскопировать и зарисовать.

Приборы, посуда, реактивы.

Спиртовка, бактериологические петли, препаровальные иглы, 96%-ный этиловый спирт, чашки Петри с посевами микроорганизмов почвы, воздуха и пищевых продуктов.

Клетки микроорганизмов, попав в питательную среду, начинают размножаться и образуют видимые невооруженным глазом колонии.

Ход работы Количественный учет микроорганизмов воздуха. Учет посева бактерий из воздуха производят путем подсчета колонии бактерий на поверхности питательной среды. Зная площадь чашки Петри, можно определить количество микроорганизмов в 1 м³ воздуха. Для этого:

1.Определяют площадь питательной среды в чашке по формуле π ŗ ²;

2. Вычисляют количество колонии на площади 1 дм²;

3. Производят пересчет количества бактерий на 1 м³ воздуха.

Примерный расчет. В чашке Петри диаметром в 10 см выросло 25 колонии.

1. Определяют площадь питательной среды в чашке по формуле π ŗ ²;

3, 14 • r²или 3, 14 • 25 = 78, 5 см².

2. Вычисляют количество колонии на площади 1 дм², равного 100 см², по пропорции:

25 колонии – 78, 5 см²

х колонии – 100 см^2.

Х = = 32 колонии,

т.е. на площади 1 дм² имеется 32 колонии.

3. Пересчитывают количество бактерий на 1 м³ воздуха, который равен 1000 л. 32 колонии бактерий на площади 1 дм² соответствует объему 10 л. воздуха. Чтобы узнать их количество в 1 м³, составляем пропорцию:

32-10

х-1000,

отсюда Х = = 3200.

Следовательно, в 1 м³ воздуха содержится 3200 бактериальных телец.

Затем приступают к качественному анализу микрофлоры воздуха. Для этого проводят описание колоний по внешней форме. Отдельные колонии микроскопируют.

По расчетам, сравнивая результаты анализа воздуха различных помещений, определяют аудиторию с меньшей и большей загрязненностью воздуха. Все результаты подсчета колоний и последующих пересчетов записывают в таблицу.

Таблица 1 Определение степени загрязненности воздуха разных аудиторий

№ аудитории	Кол-во микроорганизмов в 1м3 воздуха	Степень загрязненности воздуха	Доминирующая форма (%)

Качественный анализ микроорганизмов воздуха . Для определения качественного состава микрофлоры воздуха используют две различные группы диагностических признаков: морфологические и культуральные, по которым необходимо описать доминирующую форму и определить ее процент.

Признаки, наблюдаемые под микроскопом, относятся к признакам морфологического характера: форма бактериальной клетки (палочки, кокки, сарцины и др.), тип роста (единичные клетки, образуют цепочки), способность к спорообразованию (форма спорообразования), подвижность, характер жгутикования, окраска по Грамму.

Для описания морфологических признаков необходимо из доминирующих колоний приготовить фиксированный окрашенный препарат и препарат живых микроорганизмов методом «раздавленная капля» и заполнить таблицу:

Таблица 2 Некоторые особенности морфологии клеток микроорганизмов, выросших на МПА

№ колонии	Микроскопическая картина (рисунок)	Форма клеток	Сочетание клеток	Подвиж-ность	Наличие спор

Культуральные признаки. Описывают и зарисовывают преобладающие, а также наиболее интересные колонии. Результаты наблюдений вносят в таблицу 3.

Таблица 3 Культуральные признаки микроорганизмов, выросших на МПА

№ колонии	Фор-ма	Диа-метр	Блеск, прозрач-ность	Цвет	Поверх-ность	Про-филь	Край	Струк-тура	Кон-сис-тен-ция	Флуо-рес-цен=ция	Рис. Коло-нии

Наиболее существенной особенностью роста микроорганизмов на плотной питательной среде является характер колонии. Описание поверхности колонии проводят по следующей схеме:

1. Форма колонии (округлая, неправильной формы, ризоидная и т.д.).

2. Поверхность колоний (гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная).

3. Профиль колонии (плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный и т.д.)

4. Блеск и прозрачность (колония блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная и т. д.

5. Цвет колонии (бесцветная – грязно-белые колонии относят к бесцветным, или пигментированная – белая, желтая, золотистая, оранжевая, сиреневая, красная, черная).

6. Размер (диаметр) колонии измеряется с помощью обычной линейкой или окулярного микрометра при малом увеличении микроскопа и указывают ее величину в мм. Чашки при этом помещают на столик микроскопа крышками вниз. Точечными называют колонии менее 1 мм в диаметре, но видимые невооруженным глазом. Мелкие колонии 1 – 2 мм, средние – 2 – 4 мм и крупные – более 4 мм в диаметре.

7. Край колонии (ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т. д.) определяют при малом увеличении микроскопа или с помощью лупы. Чашку помещают на столик микроскопа, как указано выше.

8. Структуру колонии (однородная, мелко – или крупнозернистая, струйчатая т. д.) определяют при малом увеличении микроскопа или с помощью лупы.

9. Консистенцию колонии определяют, прикасаясь к ее поверхности петлей. Колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар, слизистой (прилипает к петле), тягучей, волокнистой (снимается целиком), хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей).

Кроме того, отмечают способность колонии эмульгироваться – одни колонии образуют в физиологическом растворе гомогенную взвесь, у других взвесь зернистая или в виде обрывков пленок.

Из каждой группы колонии, выросших на плотных средах, готовят препарат и определяют по форме клеток, к какому роду микроорганизмов они относятся. Из общего числа микроорганизмов, развивающихся на МПА, можно выделить следующие роды:

Род Pseudomonas. На МПА образует колонии круглые, неправильной формы, плоские, выпуклые, слизистые и пастообразные, просвечивающие, бесцветные или пигментированные (грязно-белые, синие, сине-зеленые, красные, желтые, бурые и черные). Характерная особенность представителей этого рода – образование сине-зеленого или желто-зеленого флуоресцирующего пигмента. Некоторые колонии удается наблюдать только в ультрафиолетовых лучах. У других видов пигменты диффундируют в среду, окрашивая ее в соответствующий цвет. Образование определенного пигмента зависит от состава и рН среды.

Клетки Pseudomonas прямые или изогнутые, часто с заостренными концами, но не спиральные. Они располагаются одиночно, парами или короткими цепочками. Размеры клеток 0, 5 –1 х 1, 5 – 4 мкм. Движутся эти микроорганизмы с помощью жгутиков (монотрихи или лофотрихи), не образуют чехлов, для них неизвестны стадии покоя. Чаще всего они – аэробы, но некоторые в анаэробных условиях могут использовать для дыхания нитраты. Клетки грамотрицательные.

Род Flavobacterium. Образуют на МПА колонии диаметром 2 – 3 мм, чаще гладкие, матовые, прозрачные, желтого цвета за счет каротиноидных пигментов, не диффундирующих в среду, встречаются желтовато- оранжевые колонии, иногда и красные. Клетки палочковидной формы (0, 25 – 0, 3 х 4, 0 мкм), слегка искривленные, большинство неподвижные (подвижные только перитрихи), расположены одиночно, иногда парами и в виде коротких цепочек, а иногда в виде нити. Характерен защелкивающийся тип деления (снеппинг – тип обособления делящихся клеток). Грамотрицательные.

Род Micrococcus. Образуют на МПА, как правило, колонии мелких и средних размеров (2 - 1 мм в диаметре). Колонии могут быть матовыми, блестящими, маслянистыми; гладкими, выпуклыми, плоскими; зернистыми, мелкоскладчатыми, пастообразной или слизистой консистенции, иногда встречаются сухие плотные колонии; цвет колонии может быть белый, серый, реже бесцветный; встречаются буроватые, желтовато-зеленые, розовые и красные. Пигменты в среду не диффундируют. Клетки мелкие (0, 2 – 1, 5 мкм в диаметре), одиночные и соединенные в пары, в ряд или в виде бесформенных скоплений. Клетки неподвижны, не образуют эндоспор. Грамположительные.

Род Sarcina. Колонии средних размеров: круглые, компактные, выпуклые, плоские, гладкие, бугристые или складчатые, зернистой структуры; матовые или жирно-блестящие; белые, желтые, лимонно-желтые, иногда розовые, красные. Клетки сферические (1, 8 – 3, 0 мкм в диаметре), соединены в пакеты из 8 или более клеток.

Род Mycobacterium. Относится к группе актиномицетов. На МПА растут медленно. В начале образуют мелкие, круглые компактные колонии, иногда приподнятые, мягкие, пастообразной или слизистой консистенции (растекающиеся по субстрату), бывают сухие крошащиеся; бугристые складчатые; матовые, блестящие, бесцветные или окрашенные (красные, оранжевые, желтые, зеленые, синие, бурые, черные). Пигмент в среду не выделяют. Молодые клетки ветвистые или угловатые с неправильными контурами (3, 0 – 7, 0 х 0, 7 мкм); с возрастом у большинства видов клеток происходит распад на кокковидные и овальные образования. Обособление делящихся клеток происходит по снэппинг-типу. Большинство видов грамположительные.

Род Bacillus. Палочковидные бактерии, способные образовать более или менее термоустойчивые споры. Во время формирования споры сохраняется палочковидная форма или наблюдается небольшое ее утолщение. По характеру роста колоний на МПА (или МПА + сусло-агар) можно иногда определить видовую принадлежность бацилл. Клетки грамположительные. Аэробы.

Bacillus subtilis – сенная палочка. Колонии сухие мелко морщинистые, бархатистые, бесцветные или розовые, срастающиеся с агаром; край колонии волнистый или слегка волнистый. Палочки короткие и тонкие – 3 – 5 х 9 мкм. Споры овальные 0, 9 х 0, 6 мкм, расположены не строго центрально, но на некоторых средах ближе к центру. Клетки подвижные (перитрихи).

Bacillus megaterium – образуют колонии гладкие; белые, выпуклые, жирно-блестящие, редко складчатые; края колонии резко очерчены или волнисто-бахромчатые. Споры овальные или цилиндрические, не шире материнской клетки, в поперечнике достигают 2 мкм. Длина клеток 5 – 7 мкм.

Bacillus mesentericus - картофельная палочка. Колонии на МПА тонкие, сухие, морщинистые, серовато-белые, не срастаются с субстратом. Палочки тонкие, длинные и короткие, подвижные (3 – 10 х 5 – 0, 6 мкм), иногда палочки соединены в длинные нити. Споры овальные и продолговатые формы (0, 9 – 0, 5 мкм). При формировании спор клетки не меняют палочковидной формы. Прорастание спор экваториальное.

Bacillus mycoides – грибовидная палочка. Образует колонии характерные: плоские, ризоидные или мицеловидные, стелющиеся по поверхности агара. Пучки нитей отходят от края колонии, образуют ложное ветвление; нити изгибают направо или налево, образуя право- или левовращающиеся формы колонии. Клетки в поперечнике – 0, 8 – 1, 2 мкм, по длине в зависимости от среды – 5 – 7 мкм, но часто 10 мкм и более. Цитоплазма вакуолизирована, с гранулами запасных питательных веществ, формы подвижные (перитрихи). Вид имеет много вариантов. Клетки грамположительные.

Bacillus cereus – колоний толстые, компактные, матовые со складчатым центром и ризоидными волнистыми краями; иногда мелкобугристые, с бахромчатыми краями, от которых отходят тонкие сплетения нитей. Клетки толстые – 1, 0 – 1, 5 мкм в поперечнике и 3 – 5 мкм длины, иногда длиннее; одиночные и соединенные в цепочки, нити. Споры овальные 1, 2 – 1, 5 х 0, 9 мкм.

Bacillus idosus - колоний сухие, матовые, плоские, мелкоморщинистые, целиком снимающиеся с поверхности агара. Клетки – тонкие прямые палочки, 2 – 3 х 0, 6 мкм, подвижные; споры овальные, несколько толще материнских клеток, вследствие чего последние раздуваются при спорообразовании. Чаще споры образуются в центральной части клетки.

Bacillus agglomerates – колонии на МПА мелкие, белые, плоские, слизистые. Клетки палочковидные 3 – 6 х 0, 4 – 0, 5 мкм, одиночные и в парах, а иногда соединены в короткие палочки; подвижные (перитрихи).

Bacillus virgulus - колонии на агаризованных средах мелкозернистые или волнистые с бахромчатыми краями. Микроорганизм образует длинные нити с частыми перегородками, распадающиеся на отельные клетки разной длины (4 – 10 х 0, 7 – 0, 8 мкм). Споры овальные, поперечник их белее поперечника клетки, поэтому при формировании спор клетки раздуваются, принимают веретенообразную или булавидную форму. Условный анаэроб.

Bacillus brevis - образуют колонии белые, иногда с желтоватым оттенком, гладкие, выпуклые или плоские блестящие с зубчатым краем, лучше развиваются на синтетических средах. Клетки размером 3 – 5 х 0, 7 – 1 мкм, подвижные (перитрихи), реже соединены в цепочки. Споры овальные 0, 8 – 1 мкм в поперечнике, расположены на концах клеток, раздувают их оболочки. Бывают грамположительными и грамотрицательными.

Bacillus polymyxa – колонии бесцветные плоские или вогнутые, гладкие и слизистые, иногда края колонии имеют пальчатые выросты, рост их на средах умеренный или хороший. Клетки (2 – 7 х 1, 0 –1, 7 мкм) одиночные, парные или в коротких цепочках; подвижные. Споры овальные, продолговатые (2, 6 х 1, 7 мкм), расположены в центре. При спорообразовании клетки раздуваются клостридиально или лимоновидно. Факультативный аэроб.

Bacillus asterosporus – образуют мелкие белые или сероватые с зеленоватым отливом плоские, нежные, слизистые гомогенные колонии. Клетки – толстые палочки (3 - 7 х 1, 0 – 1, 2 мкм), одиночные или в парах. Подвижные, споры цилиндрические или продолговатые (1, 5 – 2, 0 х 1, 0 мкм), расположены в центральной части клеток. Последние при спорообразовании принимают клостридиальную форму.

Bacillus simplex – колонии гладкие, жирно-блестящие, иногда слизистые, выпуклые, рост хороший. В старых культурах отдельные штаммы приобретают желтовато-бурую окраску. Клетки мелкие 2, 5 – 0, 6 мкм, обычно одиночные, цепочки не обрезают. Споры овальные (0, 9 х 0, 6 мкм), расположены субтерминально. Обитатели разных почв.

Род Actinomycets – лучистые грибки. Образуют плотные кожистые колонии различной структуры (гладкие, бугристые, складчатые, бородавчатые с мучнистым налетом). Колонии могут быть разных оттенков, срастаются с субстратом и состоят из несептированных ветвящихся нитей.

Количественный учет микроорганизмов почвы. Чтобы установить количество клеток бактерий в 1 г. сырой почвы, число колонии в чашке умножают на степень разведения, т.е. число, показывающее во сколько раз в каждом конкретном случае разбавили 1 г почвы. При этом во всех случаях, казалось бы, должно получиться примерно одинаковое число, однако практически это не совсем так. Иногда клеток так много, что развившиеся колонии микроорганизмов сливаются – это часто наблюдается в чашках при разведении 10^-2. При высоких разведениях вырастают единичные колонии меньше десяти, которые могут образоваться от случайно попавших клеток из воздуха при внесении в чашку суспензии или питательной среды. Учет таких чашек сделает подсчет недостоверным. Для правильного определения численности клеток подсчитывают только такие чашки, в которых колонии свыше десяти и не более 250 – 300 (в последнем случае при условии, если колонии очень мелкие). При подсчете колонии чашки просматривают в проходящем свете и, чтобы дважды не подсчитывать одни и те же колонии, отмечают их фломастером по стеклу. Чтобы не пропустить мелкоточечные колонии, чашки дополнительно просматривают под лупой.

Все результаты подсчетов колоний и последующих пересчетов записывают в таблицу 4.

Таблица 4 Определение количества микроорганизмов в почве

№ аудитории

Кол-во микроорганизмов в 1м3 воздуха

Степень загрязненности воздуха

Доминирующая форма (%)

Для качественной характеристики микрофлоры почвы описывают доминирующие колонии по внешним признакам и их микроскопируют. Методика и форма записи такая же, как в таблицах 2 и 3.

Количественный и качественный учет микроорганизмов микрофлоры пищевых продуктов проводят по методикам, описанным выше.

2 Контрольные вопросы

1) Что Вы понимаете под термином «общее микробное число»?

2) Какие микроорганизмы относят к санитарно-показательным?

3) Каким требованиям должны подчиняться санитарно-показательные микроорганизмы?

4) Для каких целей используют дифференциально-диагностические среды?

Лабораторная работа № 9

Молочнокислое брожение

1.1 Цель работы – познакомиться с возбудителями молочнокислого брожения и научиться определять кислотность молока.

Задание

1. Определить кислотность свежего и скисшего молока.

2. Приготовить фиксированный препарат молочнокислых бактерий. Микроскопировать с иммерсией и зарисовать микроорганизмы.

Приборы, посуда, реактивы.

Микроскоп и осветитель; микробиологическая петля; предметные стекла обезжиренные; покровные стекла; стерильные пипетки на 1-2 мл; капельница с водой; хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага; спиртовка; бюретка для титрования, колбочки, красители (метиленовый синий), капельница с 96% спиртом, иммерсионное масло, дезинфицирующий раствор, 0, 1 н NaOH, спиртовый раствор фенолфталеина, молоко (свежее и скисшее), спирт: эфир (1: 1).

Молочнокислым брожением называется процесс разложения углеводов молочнокислыми бактериями с образованием преимущественно молочной кислоты. По характеру брожения в настоящее время различают две группы молочнокислых бактерий: гомоферментативные (однотипнобродящие) и гетероферментативные (разнотипнобродящие) бактерии. Гомоферентативные бактерии образуют молочную кислоту в качестве почти единственного продукта брожения углеводов с ничтожным содержанием побочных продуктов. Гетероферментативные молочнокислые бактерии образуют всегда наряду с молочной кислотой значительные количества других продуктов. Например, уксусную и янтарную кислоты, этиловый спирт, углекислый газ и водород, ароматические вещества.

Ход работы Определение кислотности молока по Тернеру. Парное молоко содержит некоторое количество молочной кислоты, которая обусловливает начальную кислотность молока. Кислотность парного молока может колебаться от 10 до 25°Т. Поэтому перед постановкой опыта необходимо установить исходную (начальную) кислотность молока, используемого в качестве питательной среды.

Кислотность определяют методом титрования молока 0, 1Н раствором NаОН при индикаторе фенолфталеине. Для титрования берут в колбочку 10 мл молока, разбавляют двойным объемом дистиллированной воды и прибавляют 2-3 капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина. Смесь хорошо перемешивают и титруют из бюретки 0, 1 н. раствором едкого натра до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 2 мин. количество щелочи, пошедшее на нейтрализацию 10 мл молока, умножают на 10 (для расчета на 100 мл молока). Полученная величина показывает кислотность молока в градусах Тернера. Градусы Тернера показывают количество мл 0, 1 н раствора NаОН, пошедшего на нейтрализацию кислотности 100 мл молока. 1°Т соответствует 9 мг молочной кислоты.

Определение конечной кислотности молока. Количество молочной кислоты, накопившейся в молоке, можно определить по градусам Тернера. Для этого в колбу берут 1 мл скисшего молока, добавляют 20 мл дистиллированной воды и по ранее описанной методике определяют кислотность (конечную). Результат титрования умножают на 100. Из полученного числа вычитают исходную кислотность. Остаток будет показывать кислотность в градусах Тернера, образовавшуюся в результате деятельности микроорганизмов. По этой кислотности можно рассчитать количество накопившейся молочной кислоты.

П р и м е р. Исходная кислотность 22°Т, а конечная - 180°Т. Тогда микроорганизмами накоплено 180 – 22 = 158°Т или 158 • 9 = 1422 мг молочной кислоты на 100 мл молока..

Для изучения морфологии молочнокислых бактерий на чистое предметное стекло петлей наносят каплю молочной сыворотки или прокисшего молока, смешивают ее с каплей стерильной воды и готовят мазок. Мазок высушивают, фиксируют спирт-эфиром или в пламени горелки и обезжиривают легким прикосновением к горячему мазку фильтровальной бумагой. Мазок окрашивают в течение З-5 мин метиленовым синим, промывают водой, высушивают, и исследуют с иммерсионной системой.

2 Контрольные вопросы

1)Из каких этапов состоит процесс брожения?

2) Какие субстраты используют молочнокислые бактерии?

3)Каков энергетический выход молочнокислого брожения?

4) Какие продукты образуются в ходе гомо- и гетероферментативного молочнокислого брожений?

Лабораторная работа № 10

⇐ Предыдущая 123 4 5 Следующая ⇒