ТЕМА: «Лабораторная диагностика гриппа»

ТЕМА: «Лабораторная диагностика гриппа»

Классификация, морфо-биологическая характеристика и антигенное строение вируса гриппа.

Семейство Orthomyxoviridae, род Influenzavirus, вирусы гриппа трех серотипов – А, В и С.

Морфология и химический состав.

Вирионы вируса гриппа наиболее часто представляет собой сферические частицы со средним диаметром 110 нм. В свежевыделенных препаратах встречаются нитевидные формы значительно большей величины.

Вирион представляет собой нуклеокапсид, окруженный внешней оболочкой. Нуклеокапсид характеризуется спиральной симметрией. Особенностью вируса гриппа является фрагментарность минус-нитевой РНК, которая обуславливает способность генома к высокой частоте рекомбинаций. Последнее играет важную роль в антигенной изменчивости вирусов гриппа.

Белки составляют до 70% массы вириона. Они представлены гемагглютинином, нейраминидазой, мембранным белком, белком нуклеокапсида, группой Р-белков. Кроме того, в составе вириона находятся углеводы, липиды.

Резистентность. Вирусы гриппа термолабильны – при 56-60^оС теряют инфекционность в течение нескольких минут. При температуре –70^оС суспензия аллантоисной культуры вируса полностью сохраняет инфекционность на протяжении нескольких месяцев. Вирусы гриппа высоко чувствительны к эфиру и дезоксихолату, УФ-лучам, а также к обычным дезинфицирующим средствам.

Культивирование. Вирусы гриппа культивируются в курином эмбрионе, в клеточных культурах и при заражении лабораторных животных.

Наиболее эффективный путь заражения куриных эмбрионов в амниотическую полость. Адаптированные штаммы пассируют в аллантоисной полости Оптимальный срок инкубации 36-48 час при 36-37^оС. Показателем размножения вируса является РГА.

Репродукция. Полный цикл репродукции вируса гриппа продолжается около 10 час, латентный период - 3 час. Отдельные стации репродукции происходит в ядре инфицированных клеток, некоторые - в цитоплазме.

Антигены. Вирусы гриппа имеют два антигена: S и V. S-антиген (soluble - растворимый) связан с РНП и наиболее часто выявляется в РСК.

Внешняя оболочка вируса гриппа, основу которой составляет гемагглютинин и нейраминидаза, иммунологически определяется как V-антиген (вирусный). V - антиген определяется несколькими методами, из которых наиболее широко используется РТГА. Он обуславливает штаммоспецифические особенности вируса. Вирусы гриппа агглютинируют эритроциты почти 20 видов животных. Наиболее часто пользуются 1% суспензиями эритроцитов кур, человека (группа крови 1/0) или морских свинок. Вирусы гриппа по специфичности S-антитела разделяются на три серотипа: А, В, С. Тип А по V-антигену подразделяется на субтипы. Вирус гриппа А наиболее подвержен изменчивости, которая связана главным образом с изменением свойств его поверхностных антигенов – гемагглютинина и нейраминидазы.

Образование в естественных условиях новых подтипов вируса гриппа происходит вследствие рекомбинации между циркулирующими вирусами. По мнению Д.К. Львова (1977 г.), появление новых пандемический вирусов происходит в результате рекомбинации между вирусами гриппа человека и птиц или животных.

Механизмы изменчивости получили название антигенный дрейф и антигенный шифт. Дрейф происходит постоянно и обусловлен точечными мутациями в тех сайтах генома, которые отвечают за синтез гемагглютинина и нейраминидазы. В результате в популяции вирусов постоянно появляются новые сероварианты, которые незначительно отличаются от исходного штамма. Но эти изменения не выходят за рамки подтипа.

Шифт обусловлен реасортацией и полной заменой генов, кодирующих синтез гемагглютинина и/или нейраминидазы. Это приводит к появлению нового подтипа вируса, который является причиной новой пандемии.

Вирус гриппа В отличается от вируса гриппа А по антигенным свойствам, изменяется только в результате дрейфа; РНК вируса гриппа С состоит из 7 фрагментов, вирус мало изменчив и не имеет нейраминидазы.

Особенности эпидемиологии, патогенеза и иммунитета при гриппе.

Источник инфекции и пути передачи. Источником инфекции является больной гриппом человек, независимо от тяжести клинической картины. Наибольшую опасность представляют больные в первые дни заболевания. Передача инфекции осуществляется воздушно-капельным путем.

Эпидемии гриппа распространяются быстро, поражают огромные массы людей на протяжении 1-1, 5 мес. Переболевают 25-60% населения. Пандемии гриппа могут возникнуть в любой части земного шара и распространяться с одного небольшого очага (Коберн, 1968 г.).

Эпидемии, вызываемые вирусом гриппа А, регистрируются во многих странах мира с интервалом в 2-3 года. Эпидемии гриппа В возникают с интервалом 4-6 лет или больше. Вирус гриппа С вызывает одиночные случаи или изредка небольшие вспышки.

После прекращения эпидемии грипп не исчезает полностью, а регистрируется в форме единичных случаев, составляя 5-10% общего числа острых респираторных заболеваний.

Патогенез. Вирус гриппа попадает в организм человека через дыхательные пути. Патогенез гриппа характеризуется двумя особенностями: четкой эпителиотропностью вируса и высокой уровнем интоксикации.

Вирус гриппа размножается в слизистых оболочках носа, зева, гортани, трахеи, бронхов. Клетки цилиндрического эпителия теряют ворсинки, ядро их деформируется, в цитоплазме в большинстве случаев образуются включения. Мерцательный эпителий слизистой оболочки носа слущивается, оголяя собственно слизистую оболочку. Через 24 часа от начала клинических симптомов уже может быть выявлен некроз эпителия слизистой оболочки трахеи и бронхов. Вирус гриппа, размножаясь и разрушая клетки эпителия, попадает не только в дыхательные пути, но и в кровь. Вирусы гриппа имеют токсические свойства, которые связаны с вирусной частицей и нейтрализуются иммунными сыворотками. Интоксикация является одним из характернейших показателей гриппозной инфекции и клиническим признаком для дифференциации от других респираторных вирусных заболеваний человека.

Вирус гриппа проявляет токсической действие на сосудистую и нервную системы, а это способствует раннему присоединению осложнений. При гриппе развивается вторичный иммунодефицит, что приводит к развитию вторичной инфекции или обострению хронических инфекций.

Иммунитет. Врожденного иммунитета при гриппе не зарегистрировано. После перенесенного заболевания в организме формируется постинфекционный иммунитет, характеризующийся тремя особенностями: типо- и штаммоспецифический, гуморальный, пожизненный.

Иммунитет к гриппу включает действие таких факторов, как образование антител в сыворотке крови и секретах дыхательных путей, интерферона, неспецифический факторов защиты.

Лабораторная диагностика гриппа: материал и методы (риноцитоскопия, вирусологический и серологический методы, экспресс диагностика).

В лабораторной диагностике гриппа и других ОРВИ наиболее широкое применение нашли экспресс-методы: иммунофлюоресценция, ИФА и возможно использование ПЦР; риноцитоскопия, позволяющие в течение 2-3 часов поставить ориентировочный диагноз. Вирусологические методы с выделением и идентификацией возбудителя используются преимущественно для эпидемиологического анализа вспышек заболеваний. Серодиагностика носит ретроспективный характер, т.к. накопление антител происходит в период реконвалесценции. Несколько более ранее накопление антител характерно для детских инфекций.

Серодиагностика осуществляется с помощью РСК, РТГА, ИФА со стандартными диагностикумами, представляющими собой наборы эталонных штаммов различных серологических типов вируса гриппа. РСК более чувствительна, чем РТГА и позволяет диагностировать грипп в очагах инфекции у 90% больных.

ТЕМА: «Лабораторная диагностика заболеваний,

Вызванных вирусами полиомиелита, Коксаки, ЕСНО»

Вирусы Коксаки и ЕСНО.

Вирусы Коксаки выделены от больных с полиомиелитоподобными заболеваниями. Они отличаются от вируса полиомиелита антигенными и некоторыми другими биологическими свойствами.

По способности вызывать вялые и спастические параличи у лабораторных животных различают вирусы Коксаки А и вирусы Коксаки В, причем у первого 24, а у второго 6 сероваров. Некоторые серовары обладают гемагглютинирующей активностью. Некоторые серовары вируса Коксаки А не культивируются в культурах тканей.

Клинические формы Коксаки-инфекции разнообразны. Вирусы Коксаки А обладают миотропностью, и к признакам вызываемых или инфекций относятся лихорадка, менингеальные явления, «герпетические» ангины, перикардиты. Вирус Коксаки В в силу своей нейротропности вызывает энцефаломиелиты, менингиты, полиомиелитоподобные заболевания; обладая кардиотропизмом, вызывает миокардиты с развитием некроза и аневризмы. Эти вирусы также могут вызывать ОКВИ и ОРВИ у детей. Иммунитет напряженный вариант-специфический.

В, С, D, G, TTV»

Вирус гепатита В (HBV)

Семейство Hepadnaviridae. Род Orthohepadnavirus. Вид HBV (ВГВ).

Сферический, диаметром 42 нм., кубический тип симметрии, сложный, ДНК содержащий.

HBsAg – поверхностный, австралийский антиген.

HbcAg – связан с сердцевиной (core); в свободном виде не циркулирует, а выявляется в составе частиц Дейна и в ядрах пораженных гепатоцитов.

HbeAg – не является составной частью частиц Дейна, а появляется в сыворотке в инкубационный период сразу после появления HbsAg. Свидетельствует об активной репликации вируса и циркуляция до 2х месяцев- хронизация процесса.

HВxAg – предположительно опосредует злокачественную трансформацию клеток печени.

→ инициируют образование антител.

→ содержание различно, что имеет диагностическое и прогностическое значение.

Патогенез. Повреждающее действие иммуноопосредовано. HBV–инфекция - пусковой механизм, запускающий каскад иммунопатологических реакций. Интеграция генома→ изменение антигенной специфичности мембран→ аутоиммунный ответ→ цитолиз гепатоцитов, инициирующий развитие прогрессирующего некробиотического процесса.

Вирус недосягаем для иммунного контроля и это один из основных механизмов хронизации HBV –инфекции. Возможность внепеченочной репликации HBV, в частности, в клетках костного мозга и крови, лимфатических узлов и селезенки. Это способствовало пониманию многосистемности поражения.

Лабораторная диагностика

Материалы для исследования: кровь, сыворотка, биоптаты печени.

1) маркеры а/г и Ig (суммарные и IgM, IgG) => ИФА

2) ПЦР

3) ДНК – полимераза

Вирус гепатита D (HDV)

Cем. Togaviridae. Род Deltavirus (Поздеев, 2001)

РНК содержащий, d = 36 нм.

- вирус не способен к самостоятельной репродукции (дефектный вирус! ) – помощник HBV (т.е. HBV – хелперная функция).

Моноинфекция вирусом ГD абсолютно невозможна! и =>

- Заражение одновременно => развитие HDB/HBV – коинфекция;

- Внедрение HDB в ранее HBV - инфицированные гепатоциты, в основном у хронических носителей HB_S Ag – суперинфекция.

Антропоноз.

В РФ не регистрируется.

Патогенез. Основная особенность – развитие микстгепатита с поражением печени под влиянием 2х гепатотропных вирусов. Полагают, что ведущую роль играет HDV.

Механизм:

1) прямое ЦПД HDV;

2) иммунный механизм: экспрессия HDAg на мембрану гепатоцитов→ каскад иммуных реакций→ иммуный цитолиз инфицированных клеток → хронизация→ суперинфекция 70 - 80%!!! → ко-инфекция (1 - 3%)-развивается острый ВГВ+ВГD-гепатит с появлением серологических маркеров сразу 2-х острых инфекций=> в основном выздоровление и хронизация 1-3%.

Лабораторная диагностика.

● анти-HDV IgM, анти-HDV IgG и суммарное количество/ ИФА;

● биоптат печени – HDAg;

● HDV-РНК / ПЦР ( в крови и биоптатах).

Вирус гепатита С (НСV).

HCV-инфекция является основной причиной формирования всей группы хронических болезней печени - хр. гепатита, цирроза, гепатокарциномы; называют “ласковым убийцей”. От хронических заболеваний печени, связанных с персистенцией вирусов гепатитов, ежегодно умирает 16 тыс. человек. На долю HCV –70% и еще 10% обусловлены микст-гепатитом С+В. В РФ и Красноярском крае регистрация гепатита С проводится с 1994 г.

Семейство Flaviviridae, род Hepacivirus.

HCV-мелкий вирус (30 - 50 нм) с +РНК, сложный.

Существенная особенность – неоднородность генотипов. Достаточно для клиники 5 генотипов: 1а, 1в, 2а, 2в, 3а. у нас чаще 1в – «японский» генотип, устойчивый к интерферону!

Патогенез. HCV-гепатотропный вирус. Непременным условием развития инфекции является проникновение HCV в гепатоциты, где и происходит его репликация. Как и при ГВ, доказана и внепеченочная репликация, в частности в мононуклеарах крови.

Принято считать, что HCV, в отличие от HВV, обладает:

- прямым ЦПД, вызывающим цитолиз инфицированных гепатоцитов при слабой иммуногенности вируса;

- но, с другой стороны, важную роль в патогенезе играют иммуноопосредованные механизмы. Подавление гуморального и клеточного иммунитета=> способствует персистированию вируса и хронизации процесса в 50-80% случаев!

Однако, основное значение в персистенции вируса HCV, как его отличительной особенности, придается его изменчивости с образованием множества одновременно существующих антигенных вариантов - квазиразновидностей, которые обладают значительными возможностями к адаптации и избегают иммунологического надзора. Причем скорость мутаций существенно превышает скорость репликации.

Лабораторная диагностика:

1) определение Ig.

- анти- HCV → ИФА и рекомбинантный иммуноблоттинг для подтверждения диагноза и выявления возможных вирусоносителей в службе переливания крови;

- анти- HCV IgM => определение в ходе лечения интерфероном может быть использовано как прогностический показатель эффективности терапии.

2) РНК- HCV- ПЦР=> - «Золотой» стандарт диагностики!

Основные понятия и положения темы.

Классификация.

ВИЧ относится к семейству Retroviridae – РНК содержащих вирусов, обладающих Е-ревертазой. В рамках семейства ретровирусов, ВИЧ принадлежит к подсемейству лентивирусов (Lentivirinae), от lente-медленный (кодограмма).

Строение вириона.

Вирионы ВИЧ имеют сферическую форму со средним диаметром 100-140 нм. ВИЧ обладает типичной для всех ретровирусов поверхностной мембраной и содержит характерную сердцевинную часть конической формы.

Сердцевина вириона содержит нуклеопротеид со спиральным типом симметрии. Нуклеопротеид окружен белковой мембраной (р24). В состав сердцевины входит обратная транскриптаза. Сердцевина окружена двойной мембраной, которую вирус приобретает при прохождении через клеточную оболочку. Оболочка вируса заключают gр120 и gр41, образующие щиты в виде барабанных палочек. Белок р17 прилежит к внутренней стороне к оболочке вируса.

Антигенная структура. 13 антигенов

· а/г изменчивость→ патогенез, вакцины;

· ВИЧ 1, ВИЧ 2 (Л. Монтанье, Африка, 1986).

Резистентность - нестоек.

- растворители жиров ( спирты, масла, детергенты –менее 10 минут; 70%-1 минута; 0, 5% р-р ГХН-1 минута; => эффективны дез. вещества для HBV).

- температура: 56º С – 2 минуты, 60º С-24 секунды, 100º С-мгновенно.

- ультрафиолет, рентгеновское излучение – относительно устойчив.

ТЕМА: «Лабораторная диагностика гриппа»