Технология полного смешивания

⇐ ПредыдущаяСтр 7 из 8Следующая ⇒

В процессе полного смешивания рост культур происходит в емкости – ферментере при интенсивном перемешивании. Перемешивание достигается продуванием воздуха или работой мешалки (или тем и другим одновременно). Во всей массе культуры условия должны быть совершенно одинаковыми. В ферментере создаются условия соответствующие одной точки кривой роста культуры. При больших потоках среды эти условия близки к фазе логарифмического роста, при малых – приближаются к условиям стационарной фазы роста культур. При таком методе может быть воспроизведена любая точка роста периодической культуры.

В установившемся режиме скорость потока среды, отнесенная к объему культуры в ферментере, называют коэффициентом разбавления. Коэффициент разбавления равняется удельной скорости роста µ.

D = = µ

где:

D – коэффициент добавления

F – скорость потока среды

V – объем культуры в ферментере

µ- удельная скорость роста

Это означает, что культура находится в устойчивом стационарном состоянии, в результате концентрация биомассы (Х) в ферментере остается постоянной. В таком случае скорость роста определяется коэффициентом разбавления. Она уравнивается с ним и концентрация субстрата (S) также остается постоянной (равномерно расходуемый субстрат обновляется с равномерной скоростью притока новой питательной среды).

При таком способе культивирования культура (вследствие возникновения феномена синхронизации роста) обладает способностью самостоятельно автоматически подстраиваться к измененным условиям процесса.

Если условия изменяются в сторону ускорения роста, то в ферментере повышается концентрация биомассы и понижается концентрация субстрата, при замедлении роста – концентрация биомассы понизится, а концентрация питающего субстрата повысится.

При кратковременном изменении условий культивирования эти состояния микробной популяции обратимы и на изменение скорости потока культура реагирует соответствующим изменением концентрации биомассы и концентрации субстрата, не выходя из стационарного состояния.

Однако, следует помнить, что чрезмерное увеличение скорости потока, причины сильно замедляющие рост, могут привести к тому, сто скорость роста (µ) окажется меньше коэффициента разбавления (F). И в таком случае культура вымоется из ферментера.

Воспроизведение в потоке определенной точки кривой роста культур широко применяется в промышленности при наращивании биомассы микроорганизмов. Хорошо отработанный периодический процесс выращивания экономически выгодно воспроизводить в проточном варианте, поскольку культура непрерывно находится в состоянии максимальной активности нужного процесса, не тратится время на освобождение емкостей и лаг-фазу.

При наращивании биомассы в проточных условиях биотехнологический процесс стремятся вести при возможно большей скорости потока, но не настолько большой, чтобы в среде оставался недоиспользованный субстрат. Таким образом получают наибольший экономический коэффициент, который при непрерывном культивировании определяют следующим образом:

D =

где:

S₀ – концентрация питательного вещества в поступающей среде

S – концентрация питательного вещества в культуре, вытекающей из ферментера

Х – концентрация биомассы в вытекающей культуре

В практике микробиологических исследований широко применяют две разновидности открытого проточного культивирования: хемостатный и турбидостатный методы.

Хемостатный метод

Хемостатный метод культивирования клеток базируется на использовании биореактора, в который с постоянной скоростью подается питательная среда и одновременно же скоростью (например, слив по уровню) отбирается клеточная суспензия. При этом объем выращиваемой суспензии остается постоянным.

Хемостат состоит из сосуда-культиватора, в который из особого резервуара поступает постоянной скоростью питательный раствор. При этом один из компонентов (обычно кислород) поступает в количестве, не достаточном для обеспечения максимальной скорости роста культуры (рис. 49). В результате реактор с биообъектом приобретает свойства саморегулирующейся системы. Например, если скорость разбавления и вымывания биомассы превышает скорость роста клеток, то наступает разбавление культуры свежей средой. Это ведет к повышению концентрации компонента, ограничивающего рост, вследствие чего скорость роста культуры увеличивается. В реакторе начинает концентрироваться биомасса. Увеличивающаяся популяция клеток активно использует субстрат, его концентрация падает, что ведет к торможению роста культуры.

Устройство хемостата:

1) устройство для вливания питательной среды;

2) выпускное приспособление для оттока культуральной жидкости с клетками;

3) система контроля скорости притока.

Рис. 2.3.3. Схема лабораторной установки для хемостатной ферментации

1- воздушный фильтр; 2 – емкость для стерильной среды; 3 – питающий и отводящий насосы; 4 – ферментатор; 5 – емкость для кислоты; 6 – пульт контроля и регулирования рН среды; 7 – воздушный фильтр; 8 - ротаметр

Самый простой вариант хемостата включает насос, постоянно нагнетающий питательную среду в биореактор, и выпускную трубу, по которой жидкость из биореактора вытекает, как только ее уровень поднимается выше горловины этой трубы.

Хемостатное культивирование основано на том, что в простейшей форме рост бактерий можно предоставить как совокупность реакций, в которых скорость роста культуры определяется самой медленной реакцией метаболизма. Хотя в растущей культуре осуществляется метаболизм многих питательных веществ, скорость роста культуры в любой момент времени определяется скоростью метаболизма лишь одного питательного субстрата. Тот субстрат, или тот компонент питательной среды, метаболизм которого осуществляется медленнее всего и который таким образом определяет скорость роста бактериальной культуры, принято называть лимитирующим фактором.

Каким же образом скорость роста культуры зависит от концентрации лимитирующего субстрата? Эту зависимость установил Моно и выразил её следующей формулой:

Уравнение Моно

µ =µ_мах*

где:

µ - удельная скорость роста

µ_{мах – максимально возможная скорость роста в данной среде}

S – концентрация лимитирующего субстрата в среде

K_s – константа Моно или константа насыщения. Она численно равна концентрации лимитирующего субстрата, замедляющей вдвое µ_{мах (т.е. =}S при µ= µ_мах)

Совершенно очевидно, что концентрация лимитирующего фактора или субстрата в среде ограничивает и концентрацию вырастающей биомассы. В случае полного использования лимитирующего фактора рост и размножение бактериальных клеток прекращается. Концентрация биомассы в ферменте в стационарном состоянии культуры определяется по формуле:

Х =

где:

y – экономический коэффициент, или доля потребленного субстрата, пошедшего на синтез биомассы

S_{0 – концентрация}субстрата в поступающей среде

S – концентрация субстрата в ферментере

Концентрацию субстрата в ферментере в стационарном состоянии культуры определяют по формуле:

S =

где:

K_s – константа Моно

D_{– коэффициент разбавления или скорость}разбавления

S – концентрация субстрата в ферментере

µ_{мах – максимально возможная скорость роста}

Скорость разбавления, или коэффициент разбавления (D) при хемостатном культивировании известен. Он равен:

где:

F – скорость потока

V_{– объем культуры}

Величина обратная скорости разбавления характеризует время полной замены имеющейся в ферменте среды новой или, что одно и то же, время пребывания в ферментере каждого компонента питательной среды:

Таким образом, следует рассматривать количественные зависимости, существующие между:

- концентрацией биомассы – Х,

- концентрацией лимитирующего субстрата – S

- скоростью роста - µ

Графически эта зависимость характеризуется хемостатной кривой, которая выглядит следующим образом:

Рис. 2.3.4. График зависимости скорости роста культуры зависит от концентрации лимитирующего субстрата

1.Концентрация биомассы

2.Концентрация субстрата

На приведенной кривой видно, что при увеличении скорости разбавления снижается концентрация биомассы и увеличивается концентрация субстрата. Причем, если вести дельнейшее увеличение скорости разбавления, то концентрация (Х) стремится к 0, т.е. при некотором значении (D) биомасса полностью вымывается из фермента. Эту скорость разбавления назначают критической (D_кр.) или скоростью вымывания клеток. Теоретически D_кр= µ_мах

Но поскольку концентрация лимитирующего субстрата в аппарате (S) не может быть больше концентрации его в поступающей среде (S₀), то:

D_кр= µ_мах*

Производительность фермента по выходу (урожаю) биомассы рассчитывают следующим образом:

R=DX

Зная основные константы K_s_,µ_махи y можно легко рассчитать параметры культуры (Х) и для любого значения при µ=D

Хемостатный метод культивирования незаменим в лабораторных исследованиях физиологии микроорганизмов и клеток тканей. В промышленности он применяется при наращивании микробной биомассы, если известно, какой именно фактор ограничивает рост.

Турбидостатный метод

Турбидостатный метод предусматривает измерение концентрации клеточной биомассы в биореакторе и ее автоматическое поддержание на постоянном уровне путем изменения скорости протока.

Турбидостат представляет собой самую простую из всех хорошо перемешиваемых систем непрерывного перемешиваемых систем непрерывного культивирования. Концентрация клеток при турбидостатном культивировании регулируется постоянной подстройкой скорости поступления питательных компонентов. Принцип работы турбидостата основан на прямом контроле концентрации биомассы. Метод осуществляется с помощью фотоэлемента и основан на измерении светорассеяния содержимого биореактора. Сигнал от фотоэлемента управляет скоростью протока жидкости, в свою очередь определяющего скорость роста культуры. Повышение концентрации клеток и соответственно светорассеяния автоматически приводят к ускорению протока жидкости, разбавляющей культуру, и, наоборот, убыль биомассы компенсируется замедлением протока.

По своей конструкции турбидостат отличается от хемостата лишь системой контроля скорости протока. Хемостатный режим используется при малом протоке, когда концентрация клеток меняется незначительно с изменением его скорости. Это облегчает саморегулировку системы. При турбидостатном режиме происходит быстрое и резкое изменение концентрации биомассы в ответ на смену скорости протока.

Это обеспечивает своевременное срабатывание фотоэлемента или другого датчика, управляющего скоростью протока жидкости через турбидостат (рис.50).

Рис. 2.3.4. Схема лабораторной установки турбидостата: 1 – фильтр; 2 – насос для подачи среды; 3 – пульт управления насосом; 4 – фотоприемник света; 5 – источник света; 6 – ферментатор

При длительном культивировании биообъекта в турбидостате возможно прилипание клеток к фотоэлементу. При засеве смешанной культуры в нем автоматически отбирается наиболее быстрорастущий вид. В определенной степени это предохраняет культуру микроорганизма от заражения посторонней микрофлорой.

В отличии от хемостата концентрацию биомассы в турбидостате выбирает оператор, а скорость разбавления и соответственно концентрация субстратов поддерживается таким образом, чтобы сохранялся заданный уровень биомассы.

Турбидостатное культивирование осуществляют обычно в тех случаях, когда лимитирующий фактор не известен или в лимитирующих количествах субстрата нет необходимости. Поэтому субстрат добавляется в ферментер в избытке. Избыток концентрации всех компонентов питательной среды делает работу турбидостата стабильной даже при удельной скорости роста культуры близкой к максимальной (µ_мах).

Турбидостат позволяет регулировать систему в широких инервалах концентраций биомассы при скорости разбавления близкой к критической (D_кр). Именно в этих условиях химостат менее стабилен.

Скорость разбавления в турбидостате всегда равна удельной скорости роста:

D= = µ

при условии Х=constanta

В свою очередь, постоянство концентрации микробной биомассы удерживают регуляцией скорости потока, которую осуществляет не оператор, а автоматическая система.

В большинстве случаев с этой целью прибегают к прямому оптическому измерению мутности биомассы, котороя зависит от концентрации клеток (Х).

Для этого ферментер оборудуют фотоэлектроколлориметром или аналогичным ему устройством, работающем по принципу светорассеявания. Если концентрация клеток остается на нужном уровне питательная среда подается с заданной скоростью, а при снижении концентрации клеток подача питательной среды прекращается. Именно этот принцип работы турбидостата обеспечивает его устойчивую работу даже при коэффициенте разбавления близком к критическому – на границе вымывания клеток.

Сигналом для подачи среды может быть не только оптическая плотность (мутность), но и любой параметр среды, поддающийся измерению электродом или другим устройством, переводящим величину измерительного параметра в величину электрического потенциала. Последний усиливается и приводит в действие работу насоса, подающего раствор или питательную среду.

Поскольку основные метаболические функции (поглощение бактериями кислорода, выделение CO₂, изменение рН), тесно связанны со скоростью роста клеток и в конечном счете с удельной скоростью роста культуры, именно эти показатели чаще других используют как измеряемые переменные при регулировке потока среды.

Непрерывное культивирование может быть:

- одностадийным (осуществляется в одном биореакторе);

- многостадийным (осуществляется в последовательно или каскадно расположенных биореакторах).

Многостадийное культивирование дает возможность внедрить принцип дифференцированных режимов, которые одновременно осуществляются в последовательно расположенных аппаратах. Например, в первом из биореакторов создают оптимальные условия для роста культуры, а во втором – для биосинтеза целевого продукта.

⇐ Предыдущая 1 2 3 4 5 678 Следующая ⇒