Нарушение состава нормальной микрофлоры

⇐ ПредыдущаяСтр 11 из 12Следующая ⇒

При различных заболеваниях нарушается количественное и качественное соотношение представителей нормальной микрофлоры, что способствует размножению патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. В этом случае развивается дисбактериоз ( дисбиоз ).

Дисбактериоз – это количественное и качественное изменение состава нормальной микрофлоры, приводящее к развитию или усугублению патологического процесса.

Причины развития дисбактериоза:

· заболевания желудочно-кишечного тракта инфекционной или неинфекционной природы;

· нерациональное применение антибиотиков и химиопрепаратов;

· неполноценное (несбалансированное) питание

(особенно у детей 1-го года жизни)

· злокачественные новообразования;

· хирургические вмешательства;

· гормональные нарушения;

· иммунодефицитные состояния.

Таким образом, дисбактериоз - это не самостоятельное заболевание, а состояние микробиоценоза, которое может наблюдаться у больных с самыми разными диагнозами.

Примеры дисбактериозов:

1. Кандидозное поражение слизистой оболочки полости рта - часто возникает у детей грудного возраста.

2. Дисбактериоз кишечника при инфекционных заболеваниях – это состояние, при котором резко уменьшается количество облигатных анаэробов и увеличивается популяция факультативных анаэробов, в результате чего в толстой кишке начинают преобладать гнилостные процессы, увеличивается газообразование, усиливается перистальтика кишечника. Наблюдается вздутие живота, болезненность при пальпации, жидкий стул.

Для лечение дисбактериоза кишечника используют препараты нормальной микрофлоры (эубиотики), содержащие живые бактерии – резиденты: бифидобактерии, лактобактерии, кишечную палочку. Например: бифидумбактерин, лактобактерин, колибактерин, бификол, бифилакт.

Применяются перорально.

3. Дисбактериоз влагалища (вагиноз). Равновесие влагалищной микрофлоры может быть нарушено под воздействием следующих факторов: изменение гормонального фона, инфекции, передаваемые половым путем, инфекционно-воспалительных заболевания органов малого таза, лечение антибиотиками, дисбактериоз кишечника. При этом происходит замещение резидентной молочнокислой флоры гарднереллами, стафилококками.

Таким образом, нормальная микрофлора играет важную роль в защите организма от патогенных микроорганизмов. В то же время представители нормальной микрофлоры при определенных условиях способны вызвать воспалительные процессы.

Возникновение заболеваний, вызванных представителями нормальной микрофлоры, может быть обусловлено следующими причинами:

1. Проникновение микроорганизмов в необычные для них места обитания - в норме стерильные (кровь, брюшная полость, легкие, мочевыводящие пути);

2. Снижение реактивности организма. У лиц с иммунодефицитами представители нормальной микрофлоры могут вызвать тяжелые заболевания. Например: генерализованный кандидоз - у больных в терминальной стадии СПИД^,а.

Отдельные представители нормальной микрофлоры используются в качестве санитарно-показательных микроорганизмов, свидетельствующих о загрязнении окружающей среды (воды, почвы, воздуха, продуктов питания) выделениями человека, с целью выявления эпидемиологической опасности. Такими микроорганизмами являются, например обитающие в кишечнике Еscherichia coli, Clostridium perfringens и Streptococcus faecalis.

Контрольные вопросы по теме занятия:

1. Охарактеризуйте нормальную микрофлору тела человека.

2. Расскажите о роли нормальной микрофлоры в организме человека.

3. Что такое дисбактериоз и причины его развития.

4. Какие заболевания могут быть вызваны представителями нормальной микрофлоры? Каковы условия возникновения этих заболеваний?

Литература для подготовки к занятию:

Основная литература:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004.

Дополнительная литература:

1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.

2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.

3. Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И. Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.

ЗАНЯТИЕ 10

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Контроль по общей микробиологии с основами химиотерапии.

УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Осуществить контроль знаний по общей микробиологии с основами химиотерапии.

ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:

1. Провести контроль знаний по общей микробиологии с основами химиотерапии.

Вопросы к тестовому компьютерному контролю по I разделу

(Морфология, физиология, генетика микроорганизмов. Дезинфекция, стерилизация. Антибиотики).

1. История медицинской микробиологии (научные открытия Л. Пастера, Р. Коха, Д.И. Ивановского, И.И. Мечникова, П. Эрлиха).

2. Принципы классификации микроорганизмов. Последовательность расположения классификационных групп микроорганизмов.

3. Таксономические категории, используемые в бактериологии. Понятие о роде, виде микроорганизмов.

4. Понятие о культуре, штамме, клоне бактерий.

5. Различия между прокариотическими и эукариотическими клетками.

6. Виды микроскопии. Использование в микроскопии ультрафиолетовых лучей, бокового освещения.

7. Увеличение и разрешающая способность светового микроскопа. Разрешающая способность иммерсионного объектива. Максимальная разрешающая способность светового микроскопа при использовании иммерсионной системы.

8. Простые методы окраски бактерий. Примеры.

9. Сложные методы окраски бактерий. Примеры.

10. Методы окраски, используемые для выявления капсулы, жгутиков, спор, зерен волютина, кислотоустойчивых бактерий.

11. Для каких целей используется окраска по Нейссеру, по Лёффлеру, по Граму, по Цилю-Нильсену?

12. Сущность, химическая основа и техника окраски бактерий по методу Грама. Различия в каких структурах бактериальной клетки позволяет выявлять окраска по Граму?

13. Методы микроскопирования для изучения микробов в живом состоянии.

14. Формы бактериальных клеток. Примеры кокковидных, палочковидных и извитых (спиралевидных) бактерий. Названия кокковидных бактерий по взаимному расположению клеток.

15. Структура бактериальной клетки.

16. Строение и функции клеточной стенки бактерий.

17. Окраска бактерий по Граму. Последовательность применения реактивов при окраске мазков по Граму. Цвет грамположительных и грамотрицательных бактерий.

18. Строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Компоненты клеточной стенки грамотрицательных и грамположительных бактерий. Примеры грамположительных и грамотрицательных бактерий.

19. Характеристика протопластов, сферопластов и L-форм бактерий.

20. Строение клеточной мембраны бактерий, ее функции.

21. Цитоплазма бактериальной клетки, ее состав, функции.

22. Нуклеоид бактерий: состав, функция.

23. Рибосомы клетки, их строение и функции.

24. Мезосомы бактерий, их строение и функции.

25. Капсула бактерий, ее состав и функция.

26. Жгутики бактерий, их строение, состав, расположение и функция. Методы выявления жгутиков бактерий. Примеры бактерий, имеющих жгутики.

27. Пили (фимбрии) бактерий, их строение и функции.

28. Механизм образования, строение, функция, способы выявления спор бактерий. Механизм и условия прорастания спор бактерий. Примеры спорообразующих бактерий (бацилл и клостридий).

29. Строение простых и сложных вирусов. Особенности культивирования вирусов.

30. Строение бактериофагов. Вирулентные и умеренные фаги. Лизогения. Лизогенная (фаговая) конверсия.

31. Классификация бактерий по типам питания и способам получения энергии. Аутотрофы и гетеротрофы.

32. Прототрофы и ауксотрофы. Факторы роста бактерий.

33. Ферменты бактерий, их функции.

34. Методы изучения ферментативной активности микроорганизмов.

35. Методы определения протеолитической активности микробов.

36. Методы определения сахаролитической активности микробов.

37. Механизмы поступления питательных веществ в бактериальную клетку.

38. Пермеазы бактерий, их состав и функция.

39. Энергетический обмен бактерий. Процессы, протекающие с затратой энергии и без затраты энергии.

40. Классификация питательных сред по составу, происхождению, назначению, примеры питательных сред.

41. Примеры питательных сред, используемых для культивирования облигатных анаэробов.

42. Характер роста бактерий в жидких и на плотных питательных средах.

43. Дыхание бактерий. Распределение бактерий по типам дыхания. Примеры аэробных и анаэробных бактерий.

44. Брожение. Примеры бактерий, способных вызывать брожение.

45. Размножение бактерий, фазы развития популяции в жидкой питательной среде.

46. Распределение бактерий по оптимальным температурным условиям роста.

47. Санитарно-показательные микроорганизмы. Понятие, примеры.

48. Микрофлора тела человека. Представители нормальной микрофлоры тела человека (кожи, полости рта, кишечника, мочеполовой системы). Роль нормальной микрофлоры организма человека.

49. Дисбактериоз (дисбиоз), Определение. Причины развития.

50. Состав и назначение пробиотиков. Примеры пробиотиков. Состав препаратов, применяемых для коррекции микрофлоры кишечника.

51. Действие физических факторов на микроорганизмы.

52. Действие химических факторов на микроорганизмы.

53. Методы и режимы стерилизации, стерилизуемые объекты.

54. Режимы пастеризации.

55. Основные группы дезинфицирующих веществ, механизмы их действия.

56. Методы и режимы дезинфекции.

57. Плазмиды бактерий, их строение и функции.

58. Фенотип и генотип бактерий.

59. Виды изменчивости микробов.

60. Фенотипическая изменчивость микроорганизмов, ее проявления.

61. Генотипическая изменчивость бактерий.

62. Мутации, виды и механизмы мутаций. Спонтанные и индуцированные мутации. Мутации, приводящие к замене одного азотистого основания на другое. Мутации, в результате которых происходит выпадение одного или нескольких азотистых оснований. Мутации, в результате которых происходит вставка одного или нескольких азотистых оснований.

63. Генетические рекомбинации, их виды, механизмы.

64. Химиотерапевтические препараты, их классификация. Примеры антибиотиков и сульфаниламидов.

65. Классификация антибиотиков по происхождению, способу получения, спектру действия, химической структуре, мишеням действия.

66. Механизмы действия антибиотиков на бактериальные клетки. Примеры антибиотиков, обладающих разным механизмом действия.

67. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

Литература для подготовки к занятию:

Основная литература:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004.

Дополнительная литература:

1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.

2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.

ЗАНЯТИЕ 12

Тема занятия: Роль макроорганизма в инфекционном процессе. Неспецифические факторы защиты организма от инфекции. Учебная цель занятия: Познакомиться с ролью макроорганизма в инфекционном процессе. Задачи занятия: Познакомиться с неспецифическими (конститутивными) защитными факторами организма, продолжить бактериологическое исследование трупного материала. Самостоятельная работа:

Приготовить мазки из посевов органов зараженного животного, окрасить по Граму, промикроскопировать.
Выполнить тестовые задания, посвященные роли макроорганизма в инфекционном процессе и характеристике неспецифических защитных факторов.

Тестовые задания Тема: Неспецифическая резистентность организма

Подберите в словаре (а-м) подходящие по смыслу термины для понятий, приведенных ниже (1-12). а) альтеринативный б) гранулема в) интерферон г) классический д) комплемент е) лактоферрин ж) лизоцим (ацетилмурамидаза) з) миелопероксидаза и) моноциты к) полиморфноядерные нейтрофилы л) резидентная м) фаголизосома 1) Фермент, обладающий противомикробной активностью. Содержится в слюне, слезах, тканевой жидкости. 2) Железосвязывающий белок сыворотки крови, содержится в грудном молоке. 3) Фактор, вырабатываемый клетками под действием индуктора (РНК). Обладает противовирусной, иммуностимулирующей и противоопухолевой активностью. 4) Ведущий механизм уничтожения микроорганизмов в очаге воспаления. 5) Образуются при хроническом туберкулезе и бруцеллезе. Представляют скопление макрофагов, содержащих бактерии, окруженные соединительной тканью. 6) Система белков сыворотки крови, являющихся важным фактором гуморальной защиты организма против инфекций. 7) Выполняют функцию фагоцитоза. Короткоживущие. 8) Выполняют функцию фагоцитоза. Способны к длительной циркуляции. 9) Путь активации комплемента с участием комплекса антиген+антитело. 10) Путь активации комплемента с участием полисахаридов, липополисахаридов и др. 11) Микрофлора здоровой кожи, представленная преимущественно грамположительными микроорганизмами. 12) Фермент, врожденный дефект которого приводит к недостаточности фагоцитоза.

Выберите из приведенного списка вещества, относящиеся к бактериальным продуктам повреждающего действия: 1) гемолизины 2) лейкоцидины 3) опсонины 4) коагулаза 5) токсоиды 6) интерферон 7) оксидаза 8) лимфокины 9) анатоксины 10) лимфотоксин

Выберите из приведенного списка клетки, обладающие фагоцитирующей способностью: 1) эозинофилы 2) В-лимфоциты 3) Т-лимфоциты 4) плазматические клетки 5) базофилы 6) макрофаги 7) полиморфноядерные нейтрофилы 8) купферовские клетки

Литература для подготовки к занятию: Основная литература:

Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред.А.А. Воробьева. М., 2004, 194-200.
Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. Под ред. Л.Б.Борисова. М., 1984, 150-162.

Дополнительная литература:

Л.Б.Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002, 215-236.

ЗАНЯТИЕ 13

Тема занятия: Иммунитет. Взаимодействие антигена с антителом in vitro. Серологические реакции, их механизм. Прямые серологические реакции. Реакции агглютинации, преципитации. Учебная цель занятия: Познакомиться с основами иммунодиагностики инфекционных заболеваний, антигенами и их свойствами, антигенной структурой бактериальной клетки, взаимодействием антигена с антителом in vitro, с механизмами серологических реакций, постановкой реакций агглютинации и преципитации. Задачи занятия: Освоить методику постановки реакции агглютинации на стекле и в пробирках, реакции кольцепреципитации. Антигены Антигенами называются вещества, несущие признаки генетически чужеродной информации и при введении в организм вызывающие развитие специфических иммунологических реакций. Природными антигенами являются белки, полисахариды, мукополисахариды, липополисахариды, высокомолекулярные препараты нуклеиновых кислот. Антигены бактерий Среди бактериальных антигенов различают структурные, непосредственно связанные с клеткой, и секретируемые во внешнюю среду. В соответствии с принадлежностью антигенов к определенным структурам бактериальной клетки различают следующие их виды:

Соматический антиген – О-антиген. Это антиген клеточной стенки бактерий. У грамположительных бактерий основным соматическим антигеном являются тейхоевые кислоты, у грамотрицательных - это липополисахарид (эндотоксин). О-антиген термостабилен.
Жгутиковый антиген – Н-антиген. Имеется только у подвижных бактерий, состоит из белка флагеллина, термолабилен.
Капсульный – К-антиген. Поверхностный антиген вещества капсулы. Имеет мукополисахаридную или белковую природу, термолабилен. Разновидностью капсульного антигена является Vi-антиген (антиген вирулентности), который имеется у возбудителя брюшного тифа.

Корпускулярными антигенами называются антигены, связанные с бактериальной клеткой, либо с другими нерастворимыми частицами, например, эритроцитами. Выделяют также растворимые антигены, например, сывороточный альбумин. К секретируемым (растворимым) бактериальным антигенам относятся экзотоксины и экзоферменты, в том числе, ферменты агрессии. Антитела Антителами называются белковые молекулы, способные к специфическому связыванию с антигенными детерминантами. Антитела относятся к гамма-глобулинам. Другое название антител – иммуноглобулины. Серологические реакции Реакция антиген-антитело представляет собой специфическое взаимодействие антигена с антителом. Продуктом этой реакции являются иммунные комплексы. Реакции антиген-антитело, происходящие in vivo – это важнейший защитный механизм устранения чужеродных антигенов из организма. Серологическими реакциями называются реакции антиген-антитело, происходящие in vitro (в пробирке). Они используются для количественного и качественного определения антигенов и антител в исследуемом материале. При постановке серологических реакций учитывают следующие условия: наличие изотонического раствора (электролита), реакция рН близкая к нейтральной и температура среды (от 20 до 37 ° С). Серологические реакции применяются с целью решения следующих задач:

для выявления неизвестного антигена (микроорганизма, белка и т.д.). При этом используют диагностические иммунные антисыворотки, которые получают путем многократной иммунизации лабораторных животных соответствующими антигенами.
для определения наличия и титра антител в сыворотке крови. Обнаружение антител проводят с использованием специальных антигенных диагностикумов (взвеси эталонных инактивированных микроорганизмов).

Таким образом, в серологических реакциях один из двух основных компонентов (АГ или АТ) всегда должен быть известным. Серологические реакции подразделяются на прямые и непрямые. В прямых серологических реакциях участвуют только антигены и антитела. Результат прямых серологических реакций наблюдается непосредственно по изменению оптических свойств раствора (образование хлопьев, помутнения, опалесценции). К прямым серологическим реакциям относятся реакции агглютинации и преципитации и флоккуляции. В непрямых серологических реакциях для визуализации результата взаимодействия антигенов и антител используются индикаторные системы. К непрямым серологическим реакциям относятся реакция связывания комплемента, реакция непрямой гемагглютинации, реакция нейтрализации токсина антитоксической сывороткой, и др. Реакция агглютинации (РА) Агглютинацией называется склеивание бактерий в результате взаимодействия с ними специфических AT. Для проведения РА необходимы три компонента: 1) АГ (агглютиноген); 2) AT (агглютинин); 3) раствор электролита (изотонический раствор хлорида натрия).В реакции агглютинации принимают участие только корпускулярные антигены (бактерии, эритроциты, нагруженные антигеном частицы латекса). Реакция агглютинации на стекле.На обезжиренное предметное стекло пипеткой наносят каплю диагностической сыворотки (разведение сыворотки 1: 10 - 1: 20). Бактериологической петлей берут чистую культуру исследуемого микроорганизма с поверхности скошенного агара, переносят в каплю сыворотки и перемешивают. Результат реакции учитывают невооруженным глазом через 3-5 мин. При положительной реакции в капле сыворотки отмечают появление хлопьев (крупных или мелких), хорошо видимых на темном фоне при покачивании предметного стекла. В случае отрицательной реакции жидкость остается равномерно мутной. Реакция агглютинации в пробирках.В ряд пробирок вносят по 1 мл физиологического раствора. В первую пробирку прибавляют равный объем исследуемой сыворотки крови. Готовят последовательные двукратные разведения сыворотки (титрование сыворотки), после чего в каждую пробирку вносят по 2 капли взвеси инактивированных бактерий (диагностикум). Пробирки помещают на 2 ч в термостат при 37 °С. Реакция протекает с образованием мелких хлопьев, невидимых невооруженным глазом, поэтому учет результатов проводят под небольшим увеличением в специальном приборе – агглютиноскопе. Интенсивность агглютинации учитывают по системе «четыре плюса»: полная агглютинация - 4+, частичная агглютинация - 3+ или 2+, сомнительный результат - +. За титр антител в исследуемой сыворотке принимают последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация на 2+. Реакцию агглютинации в пробирках (развернутая реакция агглютинации) проводят для определения титра антител к возбудителям брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), бруцеллеза (реакции Райта), сыпного тифа (реакция Вейгля). Реакция преципитации (РП) Реакцией преципитации называется осаждение из раствора АГ (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) в растворе электролита. Осадок представляет собой макромолекулярный иммунный комплекс (преципитат). Выпадение нерастворимого комплекса антиген-антитело в виде осадка наблюдается лишь при эквивалентных соотношениях ингредиентов – в зоне эквивалентности. Зоной эквивалентности называется область, в которой все антитела количественно связаны с антигеном. При избытке антигенов или антител образовавшийся осадок растворяется. В реакции преципитации принимают участие только растворимыеантигены (экстракты из микроорганизмов, органов и тканей, продукты распада клеток микроорганизмов — лизаты, фильтраты и т.д.). Антитела способные вызывать преципитацию антигена должны иметь не менее двух валентностей. Преципитирующие сыворотки изготавливают путем гипериммунизации животных (кроликов). Реакция кольцепреципитации.В пробирку наливают 1, 0 мл неразведенной преципитирующей сыворотки. Пипеткой медленно наслаивают по стенке пробирки (пробирку держат в наклонном положении) АГ в таком же объеме. Затем пробирку осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении АГ на сыворотку четко видна граница между двумя слоями жидкости. Результаты реакции учитывают через 1-2 минуты. В случае положительной реакции в опытной пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде белого кольца. С помощью РП можно выявить не только видовую, но и групповую специфичность белка. Например, определить степень родства различных видов животных и растений. В судебной медицине РП используется для определения видовой принадлежности белка (сыворотки крови). Применение РП для санитарно-гигиенического контроля пищевых продуктов позволяет выявить фальсификацию мясных, рыбных, мучных изделий, примеси в молоке и т.д. Недостатками РП является нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании, а также невозможность установить количество разных АГ, участвующих в формировании преципитата. Этих недостатков лишены реакции преципитации в геле. К ним относятся реакция иммунодиффузии по Оухтерлони, и реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини. Реакция встречной иммунодиффузии по Оухтерлони.Метод иммунодиффузии основан на встречной диффузии антигена и антител в агаровом геле. Для постановки реакции расплавленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку, после затвердевания в нем вырезают лунки диаметром 2-3 мм, которые заполняют антигеном или сывороткой. Антиген и антитела диффундируют навстречу друг другу и в месте контакта в эквивалентных соотношениях образуют линии преципитации, в виде белой полосы. Реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини.При постановке реакции радиальной иммунодиффузии по Манчини в расплавленный агар вносят иммунную сыворотку. После застывания геля в нем делают лунки, в которые помещают антиген. Антиген, диффундируя в гель, взаимодействует с антителами, присутствующими в агаре. В результате образуется радиальная зона преципитации, диаметр которой пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для количественного определения содержания в крови иммуноглобулинов различных классов. Реакция флоккуляции Реакцией флоккуляции называется появление опалесценции или хлопьевидной массы при добавлении в пробирку с токсином (анатоксином) антитоксической сыворотки. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина. Самостоятельная работа:

Поставить реакцию агглютинации на стекле с дизентерийными сыворотками и культурой неизвестного микроорганизма.
Поставить развернутую реакцию агглютинации с сывороткой крови больного брюшным тифом и брюшнотифозным диагностикумом (реакция Видаля).
Поставить реакцию кольцепреципитации с целью определения видовой принадлежности сыворотки крови.

Контрольные вопросы по теме занятия:

Современное определение понятия “иммунитет”. Виды (формы) иммунитета.
Антигены, гаптены, их свойства.
Антигенная структура бактериальной клетки.
Взаимодействие антигена с антителом ин витро. Прямые и непрямые серологические реакции.
Реакция агглютинации, ее механизм и практическое применение.
Реакция преципитации, ее механизм и использование.

Литература для подготовки к занятию: Основная литература:

Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред.А.А. Воробьева. М., 2004, 201-248, 283-288.
Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. Под ред. Л.Б.Борисова. М., 1984, 107 – 111, 115 - 117.

Дополнительная литература:

Л.Б.Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.
О.К.Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕД, 2001.
Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И.Покровского и О.К.Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.

ЗАНЯТИЕ 15

Тема занятия: Лабораторные методы оценки функционального состояния Т- и В-систем иммунитета. Учебная цель занятия: Ознакомиться с основными методами лабораторных исследований Т- и В-систем иммунитета, значениями некоторых иммунологических показателей, характеризующих состояние Т- и В-звеньев иммунитета. Задачи занятия: Ознакомиться с методикой постановки реакций розеткообразования для подсчета Т- и В-лимфоцитов, реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Определить значение отдельных показателей иммунограммы для оценки состояния иммунитета. Методика постановки иммунологических реакций:

Кровь для исследования в количестве 1 – 2 мл берут из локтевой вены в пробирку с раствором гепарина. Для отделения лейкоцитов от эритроцитов пробу крови осторожно наслаивают на раствор, содержащий смесь фиколл-верографин или фиколл-гипак (плотность раствора 1, 077 г\мл) и центрифугируют при 1, 5 тыс об\мин в течение 40 – 45 мин. Эритроциты оседают на дно пробирки, а лейкоциты, обладающие меньшей плотностью, остаются в верхней части пробирки в виде мутного кольца. Фракцию лейкоцитов осторожно отсасывают пипеткой и двукратно отмывают путем центрифугирования средой 199.
Реакция розеткообразованияиспользуется для количественного определения содержания Т- и В-лимфоцитов. Вследствие качественных различий рецепторов на клеточных мембранах Т- и В-лимфоциты различаются по способности адсорбировать эритроциты животных. Т-лимфоциты способны адсорбировать эритроциты барана и называются Е-розеткообразующие клетки (Е-РОК). В-лимфоциты адсорбируют эритроциты мыши и называются М-РОК. Для постановки реакции розеткообразования взвесь лейкоцитов смешивают с предварительно отмытыми эритроцитами животного (соотношение эритроциты: лимфоциты должно соответствовать 20: 1 – 50: 1). Смесь выдерживают 10 мин при 37 °С, затем центрифугируют и оставляют на 18 часов при 4 ° С. На предметном стекле готовят тонкий мазок из клеточной суспензии, окрашивают по Романовскому – Гимзе, микроскопируют с объективом x 40. При подсчете 300 лимфоцитов определяют процент клеток, адсорбировавших на себе 3 и более эритроцитов. В норме у взрослых людей содержится 60 – 67% Е-РОК и 6 – 12% М-РОК. 20 – 25% лимфоцитов не способны образовывать розетки. Они называются нулевыми клетками (0-клетки). Это популяция Т-лимфоцитов, включающая натуральные Т-киллеры, а также незрелые Т- и В-лимфоциты.
Определение содержания CD4 и CD8 клеток. Популяция Е-РОК состоит преимущественно из CD4 и CD8 лимфоцитов. Для их количественного определения ставят реакцию розеткообразования с эритроцитами барана в присутствии теофиллина. Теофиллин повышает уровень внутриклеточного цАМФ и ингибирует реакцию розеткообразования CD8. Таким образом, при параллельной постановке реакции розеткообразования с теофиллином и без него можно определить количество хелперов (теофиллинрезистентные клетки) и суммарное количество CD4 и CD8 клеток.

Количество CD8 (теофиллинчувствительные клетки) определяется по формуле: Тфч = Е-РОК – Тфр. В норме у здорового человека количество Т-хелперов составляет 50 – 60%, Т-цитотоксических лимфоцитов – 12 – 20% от общего числа лимфоцитов. Соотношение CD4: CD8 (в процентах) составляет 1, 3 – 7, 5. Уменьшение этого показателя до 1, 0 или менее свидетельствует о наличии иммунодефицита.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Бласттрансформацией называется феномен превращения лимфоцитов в крупные делящиеся клетки под действием специфических и неспецифических митогенов. Некоторые полисахариды растительного происхождения (фитогемагглютинины) способны при добавлении к суспензии лимфоцитов вызывать неспецифическую бласттрансформацию Т-лимфоцитов. Способность образовывать бласты в ответ на стимуляцию ФГА отражает степень готовности иммунной системы к иммунному ответу. Количество образующихся бластных клеток оценивают через 24 часа инкубации лимфоцитов с митогеном путем микроскопии либо радиоизотопным методом. В норме у взрослого человека после стимуляции ФГА не менее 70% лимфоцитов должно превращаться в бласты. Снижение этого показателя свидетельствует об угнетении иммунной системы. При постановке РБТЛ с определенными антигенами (микробными, вирусными) можно определить клеточную реакцию на конкретный антиген. При этом образовывать бласты будут клетки, несущие рецепторы к данному антигену.

Основные правила интерпретации иммунограмм:

Комплексный анализ иммунограммы более информативен, чем оценка каждого показателя в отдельности.
Анализ иммунограммы в динамике всегда более информативен как в диагностическом, так и в прогностическом отношении, нежели однократно полученная иммунограмма.
Реальную информацию несут лишь сильные сдвиги показателей.
Полноценный анализ иммунограммы можно проводить лишь в комплексе с оценкой клинической картины заболевания у данного пациента.
Отсутствие существенных сдвигов показателей иммунограммы при наличии выраженной картины воспалительного процесса свидетельствует об атипичной реакции иммунной системы и является отягощающим признаком течения процесса.
В подавляющем большинстве случаев анализ иммунограммы позволяет делать ориентировочные, а не безусловные выводы.

Приложение 1 Средние значения показателей иммунограммы у взрослых здоровых людей

Показатель	Условное обозначение	Среднее значение
Лейкоциты /109 в 1 л/	L	5, 6
Моноциты, %	М	6, 2
Эозинофилы, %	Э	2, 2
Базофилы, %	Б	0, 4
Палочкоядерные нейтрофилы, %	П	1, 5
Сегментоядерные нейтрофилы, %	С	60, 3
Лимфоциты, %	Л	9, 4
Т-лимфоциты, %	Т /Е-РОК/	67, 3
В-лимфоциты, %	В /М-РОК/	8, 2
Нулевые Т-лимфоциты, %	О	24, 5
Т-хелперы, % (CD4)	Тх /Тфр/	55, 6
Т-цитотоксические, % (CD8)	Тц /Тфч/	12, 7
CD4/ CD8	Соот	1, 3 – 7, 5
Адгезия фагоцитов, %	Фа /Е-РОН/	25, 4
Захват фагоцитов, %	Фз Д – Ф/	45, 0
СОЭ, мм		8, 0
Иммуноглобулины G, г/л	Ig G	9, 8
Иммуноглобулины М, г/л	Ig М	1, 0
Иммуноглобулины А, г/л	Ig А	1, 8
Иммуноглобулины Е, МЕ/мл	Ig Е

Приложение 2

⇐ Предыдущая 3 4 5 6 7 8 9 101112 Следующая ⇒