Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов

⇐ ПредыдущаяСтр 8 из 12Следующая ⇒

Необходимым условием при культивировании анаэробов является защита их от токсического воздействия молекулярного кислорода. Это достигается при помощи физических, химических и биологических методов.

Физические методы:

1. Регенерация сред. Для удаления растворенного в питательных средах кислорода производят их кипячение в течение 15-20 минут на водяной бане с последующим быстрым охлаждением до 45-50°С. После посева культуры для предотвращения проникновения кислорода в жидкую питательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином.

2. Посев в “высокий столбик агара”. Питательную среду разливают в пробирки по 10 мл и прогревают на кипящей водяной бане для удаления кислорода, после чего охлаждают до температуры 45°С и вносят исследуемый материал. Пробирки с посевами помещают в обычный термостат. В высоком столбике плотной или полужидкой питательной среды кислород воздуха диффундирует обычно на расстояние 1, 5-2, 0 см от поверхности, а в глубине остаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов.

3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в механическом удалении воздуха из герметически закрытого сосуда, который называется анаэростат, при помощи вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом или бескислородной газовой смесью.

Химические методы:

1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде

2. Применение гидросульфита натрия для поглощения кислорода из замкнутого пространства.

3. Использование редуцирующих веществ. Для связывания остатков кислорода в питательных средах используют вещества-редуценты, к которым относятся тиогликолевая кислота, аскорбиновая кислота, различные сахара, цистин и цистеин.

4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пластиковых пакетах). Для образования водорода и двуокиси углерода используют специальные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород генерируется таблетками боргидрида натрия. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия.

Биологический метод

Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). На одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают исследуемый материал, а на другую – лабораторную культуру известных аэробных бактерий. После посева чашку герметично закрывают крышкой. Вначале вырастают аэробы, поглощающие кислород, а затем – анаэробы.

Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов

Для получения изолированных колоний облигатных анаэробов используют следующие методы:

Метод Цейсслера. Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэростат и выдерживают в термостате при 37°С в течение 24-72 часов.

Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл изотонического раствора хлористого натрия, перемешивают запаянным капилляром и переносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45-50°С сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают. Пробирки инкубируют в обычном термостате.

Метод Виньяля-Вейона. В пробирку с 0, 5% расплавленным и охлажденным до температуры 40-45°С сахарным агаром вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Затем содержимым пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов.

Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала в 0, 5% расплавленном агаре. Содержимое пробирки выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках располагается стеклянная пластинка размером 6x6 см. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри.

Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод “перевернутых чашек”. При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают ее стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином и термостатируют при 37°С до появления изолированных колоний анаэробов.

Выращивание чистой культуры анаэробов производят путем посева материала из изолированной колонии на среду Китта-Тароцци, в состав которой входит мясной бульон, глюкоза и кусочки печени или фарша. Для предотвращения доступа кислорода среда покрыта слоем вазелинового масла.

Контрольные вопросы по теме занятия:

1. Ферменты бактерий.

2. Методы изучения ферментативной активности микроорганизмов.

3. Дыхание бактерий.

4. Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

Литература для подготовки к занятию:

Основная литература:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004.

Дополнительная литература:

1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.

2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.

3. Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И. Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.

ЗАНЯТИЕ 6

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Вирусы, их структура. Вирусы бактерий – фаги. Фаги вирулентные и умеренные, их взаимодействие с бактериальной клеткой. Изменчивость микроорганизмов. Фенотипическая и генотипическая изменчивость.

УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучить строение вирусов и бактериофагов. Изучить различия между фагами вирулентными и умеренными, их взаимодействие с бактериальной клеткой. Познакомиться с фенотипической и генотипической изменчивостью микроорганизмов.

ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:

1. Изучить структуру вирусов и бактериофагов.

2. Изучить различия между фагами вирулентными и умеренными, их взаимодействие с бактериальной клеткой.

3. Познакомиться с фенотипической и генотипической изменчивостью микроорганизмов.

Структура вирусов

Вирусы – это микроорганизмы, не имеющие клеточного строения, проходящие через бактериальный фильтр и не способные к росту вне живых клеток. Элементарной сформировавшейся вирусной частицей является вирион.

Морфологию вирусов изучают с помощью электронной микроскопии, так как их размеры малы (18 - 400 нм) и сравнимы с толщиной оболочки бактерий.

Форма вирионов может быть различной:

- палочковидной (вирус табачной мозаики);

- пулевидной (вирус бешенства);

- сферической (герпесвирусы, ВИЧ);

- нитевидной (филовирусы);

- овальной (вирус оспы);

- в виде сперматозоида (многие вирусы бактерий - бактериофаги).

Химический состав всех вирусов представлен белками и нуклеиновыми кислотами (ДНК или РНК). Вирусы средних и крупных размеров содержат также липиды, углеводы. Белки составляют от 49, 1 до 89%, нуклеиновые кислоты - от 3, 5 до 40% всей массы вирусов.

Вирусы состоят из центральной части - нуклеоида (генома) и белковой оболочки – капсида. Нуклеоид - это генетический аппарат вирусов, представленный РНК или ДНК. Поэтому выделяют РНК-содержащие вирусы и ДНК-содержащие вирусы. Различают просто устроенные вирусы и сложно устроенные вирусы. У просто устроенных вирусов нуклеиновая кислота окружена капсидом, образуя нуклеокапсид. Сложно устроенные вирусы кроме нуклеокапсида имеют суперкапсид - дополнительную оболочку. Суперкапсид состоит из двойного слоя липидов и специфических вирусных белков. Суперкапсид выполняет функции защиты генома, прикрепления к восприимчивой клетке и проникновения в ее цитоплазму, а также определяет многие свойства вирусов: гемагглютинацию, гемадсорбцию, слияние клеток, чувствительность к повреждающим факторам и др.

Под оболочкой некоторых вирусов находится матриксный М-белок. Это белок располагается между суперкапсидом и нуклеокапсидом.

Вирусные белки делятся на структурные и неструктурные. Структурными называются белки, входящие в состав зрелых внеклеточных вирионов. Неструктурные белки – это белки, кодируемые вирусным геномом, но не входящие в состав вириона. Они участвуют в репродукции вирусов внутри инфицированной клетки.

По признаку симметрии капсида вирусы делятся на 3 группы:

I группа - вирусы, имеющие спиральный тип симметрии. Этот тип симметрии характерен для вирусов крупных размеров (рабдовирусы, вирусы гриппа, парагриппа, коронавирусы). Капсиды их состоят из капсомеров, уложенных в спирали одинакового диаметра. Витки спирали тесно прилегают друг к другу, образуя трубочку. При этом укладка спиралей определяет форму вирусных частиц (палочковидная, пулевидная или нитевидная форма).

II группа - вирусы, имеющие кубический тип симметрии. Вирусы, имеющие кубическую симметрию, называют сферическими. Такой тип симметрии имеют аденовирусы, пикорнавирусы (вирусы герпеса, ящура, полиомиелита).

III группа - вирусы, имеющие комбинированный тип симметрии. Такой тип симметрии характерен для бактериальных вирусов (бактериофагов). Например, у Т-чётных бактериофагов головка имеет форму многогранника (кубическая симметрия), а хвостовой отросток – форму спирали (спиральная симметрия).

Бактериофаги

Бактериофаги - это вирусы бактерий.

Морфология.

Выделяют 5 основных типов бактериофагов в зависимости от типа нуклеиновых кислот (ДНК-содержащие и РНК-содержащие фаги), строения, типа симметрии:

1. Нитевидные ДНК-содержащие фаги, которые лизируют клетки бактерий, несущих F-плазмиду.

2. Фаги с аналогом отростка.

3. Фаги с коротким отростком.

4. Фаги с несокращающимся чехлом.

5. ДНК-содержащие фаги с сокращающимся чехлом отростка, заканчивающимся базальной пластиной. Их строение:

1. Головка фагов имеет кубический тип симметрии, состоит из белковой оболочки, построенной из отдельных субъединиц и заключенного в ней ДНКового генома, размеры головки около 100нм. Геном фагов образован спирально упакованной двойной нитью ДНК.

2. Отросток (хвост) фагов имеет длину около 100 нм, включает полый стержень, сконструированный по типу спиральной симметрии и сократительный чехол. В дистальном отделе стержня расположена 6-угольная базальная пластина с 6-ю шипами и 6-ю отростками (фибриллами). У некоторых фагов в дистальной части отростка находится фермент лизоцим, растворяющий клеточную стенку бактерии.

По сравнению с вирусами человека бактериофаги более устойчивы к различным физическим и химическим воздействиям. Они хорошо переносят высокие температур (50-60 ⁰С), действие дезинфицирующих средств, УФ-облучение в низких дозах.

⇐ Предыдущая 3 4 5 6 789 10 11 12 Следующая ⇒