Выделение чистых культур патогенных клостридий

Исследуемый материал:

Посев на плотные среды: чашка с кровяным агаром, чашка с бензидиновым агаром, чашка со средой Виллиса-Хоббс, пробирки со средой Вильсон-Блера Инкубация в анаэробных условиях при 37° в течение 1-7 суток.

Посев на жидкие среды для накопления (мясные, казеиновые). Инкубация при 37° в течение от 16 часов до 15 суток. Выросшие культуры, содержащие массу грамположительных палочек, пересевают на плотные среды, как указано.

Микроскопия и пересев на мясную или казеиновую среду колоний, вызывающих гемолиз, покраснение, опалесценцию или почернение на одной из указанных сред и состоящих из грамположительных палочек, для получения чистых культур и последующего изучения их свойств.

Среда Виллиса-Хоббс : смесь (400 мл бульона Хоттингера + 4, 8 грамма агара; 4, 8 грамма лактозы и 1, 3 мл 1% раствора нейтрального красного) автоклавируют, охлаждают до 55-50 и добавляют 15 мл суспензии яичного желтка и 60 мл стерильного обезжиренного молока.

2. Причины высокой чувствительности строгих анаэробов к кислороду объясняют следующими обстоятельствами:

1. Отсутствием у них каталазы (в присутствии кислорода накап-
ливается перекись водорода, которая и оказывает бактерицидное
действие на анаэробы).

2. В аэробных условиях тормозятся анаэробные энергетические
процессы (пастеровский эффект).

3. Отсутствием у анаэробов систем регуляции окислительно-
восстановительного потенциала. В присутствии кислорода он повы-
шается, анаэробы не могут понизить его до необходимого уровня, и
поэтому их рост подавляется.

З А Н Я Т И Е6

Дата ______________

Тема: Бактериологический метод (3 день). Идентификация чистых культур бактерий. Биохимическая активность бактерий.

Итоговое контрольное занятие «Морфология и физиология бактерий».

План занятия:

1. Ферменты бактерий. Регистрация результатов посева на среды пестрого ряда.

2. Регистрация результатов опыта с посевами бактерий на среды Эндо, Плоскирева и МПА.

3. Итоговый контроль по теме «Морфология и физиология бактерий».

Методические указания

1. Зарегистрировать результаты посева на среды «пестрого ряда» кишечной палочки и фекального щелочеобразователя. Ферментация углевода с образованием кислоты и газа обозначается буквами КГ; с образование только кислоты - буквой К. Свертывание молока и образование индола обозначается +; отсутствие ферментации углевода, свертывания молока или образования индола и сероводорода обозначается знаком -.

Результаты посева на среды “пестрого ряда”.

Виды бактерий	Глюкоза	Лактоза	Маннит	Сахароза	Молоко	Индол	H₂S	Подвижность
Кишечная палочка
Фекальный щелочеобразователь

Заключение: _____________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________

2. Отметить различия в характере роста кишечной палочки и фекального щелочеобразователя (размер, прозрачность и окраска колоний на средах Плоскирева и Эндо), а также интенсивность роста их и стафилококка на средах Плоскирева, Эндо и МПА. В случае роста бактерий в виде отдельных колоний подсчитать количество колоний каждого вида бактерий на всех средах. Результаты зарисовать и зарегистрировать в таблице.

Результаты посева на среды Плоскирева, Эндо, МПА

Микроорганизм	Количество колоний или степень интенсивности роста на средах
Плоскирева	Эндо	МПА
Кишечная палочка
Фекальный щелочеобразователь
Стафилококк

МПА	Среда Эндо
1. Escherichia coli; 2. Alcaligenes faecalis; 3. Staphylococcus

Вопросы к итоговому контролю по теме «Морфология и физиология бактерий».

1. Строение бактериальной клетки.

2. Спора бактерий, строение, назначение, отличия от спор грибов.

3. Основные компоненты белоксинтезирующей системы бактерий.

4. Принцип фазовоконтрастной микроскопии.

5. Принцип темнопольной микроскопии.

6. Основные отличия между прокариотами и эукариотами.

7. Основные типы культур бактерий.

8. Признаки, применяемые для идентификации микроорганизмов.

9. Определения всех методов микробиологической диагностики.

10. Структура жгутика бактерий.

11. Классификация бактерий по количеству и взаиморасположению жгутиков.

12. Методы определения подвижности бактерий.

13. Структура пептидогликана.

14. Принцип окраски бактерий по Граму, отличия клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

15. В каких случаях употребляются термины «бактерии», «бациллы», «клостридии»?

16. Что такое L-формы бактерий, в каких случаях они возникают?

17. Методы выявления спор у бактерий.

18. Что такое нумерическая таксономия?

19. Что такое конститутивные, индуцибельные, репрессибельные ферменты?

20. Отличия между ядерным аппаратом прокариот и эукариот.

21. Структура и функции цитоплазматической мембраны.

22. Функции клеточной стенки бактерий.

23. Что такое мини-клетки, когда они образуются?

24. Типы дыхания бактерий, сущность и разница.

25. Строение и функции липополисахарида клеточной стенки.

26. Что такое «вид» микроорганизма?

27. Что такое архебактерии?

28. Классификация бактерий по морфологии и взаиморасположению.

29. Механизм деления бактерий. Время жизни клетки (формула).

30. Механизмы поступления питательных веществ в бактериальную клетку.

31. Активный транспорт веществ у бактерий.

32. Классификации питательных сред, требования к ним.

33. Что такое плазмиды?

34. Что такое микроаэрофилы?

35. Причины чувствительности анаэробов к молекулярному кислороду воздуха.

36. Состав среды Китта-Тароцци.

37. Состав и химизм работы среды Вильсон-Блера.

38. Что такое волютин, как его выявляют и у каких бактерий?

39. Этапы выделения чистой культуры возбудителя.

40. Как изучают протеолитические свойства бактерий?

41. Как изучают сахаролитические свойства бактерий?

42. Методы культивирования анаэробов.

43. Определение подвижности бактерий по Пешкову.

44. Как у бактерий определяют способность выделять индол?

45. Как у бактерий определяют способность выделять сероводород?

46. Состав среды Эндо, как на ней растут разные кишечные бактерии?

47. Как изучают развернутые биохимические свойства бактерий?

48. Какой состав имеют МПА и МПБ?

49. Как судят о чистоте выделенной культуры микроорганизма?

50. Актиномицеты, морфология, друза.

51. Плесневые (нитчатые) грибы, родовые морфологические отличия.

52. Микроскопическая дифференциальная диагностика малярии.

53. Назвать патогенных простейших из класса Flagellata.

54. Морфология трипаносом, какие заболевания они вызывают?

55. Морфологические отличия дрожжей и дрожжеподобных грибов Candida.

56. Морфология токсоплазмы, ее роль в патологии человека.

57. Диагностика амебиаза, морфология и жизненный цикл возбудителя.

58. Морфологические отличия возбудителя вивакс и тропической малярии.

59. Чем отличается лейшманиальная форма лейшмании от лептомонадной?

60. Патогенные спирохеты, морфология и классификация.

61. Что такое стерилизация и дезинфекция?

62. Методы стерилизации.

63. Методы контроля качества стерилизации.

З А Н Я Т И Е7

Дата ______________

Тема: Бактериофагия. Генетика микроорганизмов. Мутации и рекомбинации.

План занятия:

1. Явление бактериофагии. Демонстрация феномена бактериофагии на жидких и плотных средах.

2. Методы титрования фага.

3. Типы и механизмы генетических рекомбинаций: трансформация, трансдукция, конъюгация (разбор схем).

а) Опыт трансдукции (разбор)

б) Постановка опыта конъюгации.

2.Плазмиды бактерий. Классы и свойства R-плазмиды.

3.Молекулярные механизмы мутаций у бактерий (разбор).

4.Получение рекомбинантных молекул ДНК (разбор).

Методические указания

1. Зарисовать феномен бактериофагии на плотной питательной среде.

2. Для титрования бактериофага используются различные методы. Наиболее точным является метод агаровых слоев, предложенный Грациа. Сущность этого метода состоит в следующем.1, 5%-ный МПА с генцианвиолетом (0, 1 мл 0, 1% генционвиолета на 1 л среды), который добавляется для предохранения от загрязнения грамположительной воздушной микрофлорой, накануне опыта разливают по 25-30 мл в чашки Петри. Чашки хорошо просушивают в термостате или под бактерицидной лампой, после чего оставляют на ночь при комнатной температуре.

Перед опытом 0, 7% МПА расплавляют и разливают по 2, 5 мл в пробирки, охлаждают до 46-47^°С и затем добавляют в пробирки по 1 мл исследуемого фага (предварительно разведенного) и 0, 1 мл эталонной культуры, все это быстро и тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями, после чего выливают в чашки на поверхность 1, 5% агара. Смесь осторожными движениями распределяют так, чтобы над слоем 1, 5% агара образовался слои 0, 7% агара, содержащего бактериофаг и чувствительную к нему культуру бактерий. Для застывания добавленного агара чашки оставляют на столе на 1-1, 5 часа, а затем помещают в термостат при 37^°С. Для получения четких результатов необходимо соблюдение следующих условий: а) чашки с 1, 5% агаром должны быть хорошо высушены; б) чашки должны находиться после добавления 0, 7% агара строго в горизонтальном положении во избежание стекания агара в одну сторону; в) расплавленный 0, 7% агар после охлаждения до 46°С нельзя долго хранить, так как он может приобрести гелеобразную консистенцию.

Учет результатов титрования можно производить после 5-6-часового инкубирования в термостате. Для этого подсчитывают количество колоний фага («стерильных» пятен) и умножают полученное число на фактор разведения. Например, при посеве 1 мл фага, разведенного в 10^-7 на чашке обнаружено 45 колоний, следовательно, титр фага равен 45× 10⁷ = 4, 5× 10⁸ Зарисовать демонстрационный опыт титрования фага по Грациа.

Бактериофагия на плотной ПС («стерильные» пятна)

Титрование фага по методу агаровых слоёв (по Грациа)

3. а) Опыт трансдукции.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиента Е. соli 1ас^- добавляют в таком же количестве трансдуцирующий фаг, выделенный из культуры Е. соli 1ас⁺, в концентрации 10⁶-10⁷. Смесь инкубируют при 37^°С в течение часа, после чего 0, 1 мл высевают на среду Эндо. В качестве контроля на среду Эндо высевают также культуру Е.соli lас⁺ (реципиент без фага). Посевы ставят на сутки в термостат. Учет результатов производят по числу выросших окрашенных колоний.

б) Опыт конъюгации.

Сущность опыта заключается в том, что от донорных клеток путем конъюгации передаются гены, контролирующие способность синтезировать треонин и лейцин, клеткам-реципиентам, ауксотрофным по этим аминокислотам.

В качестве донора используется культура Е. coli Hfr с генотипом tre⁺, lei⁺, met^-, str^s (str^s– чувствительность к стрептомицину). Реципиентом служит культура Е. coli F^–с генотипом tre^-, lei^-, met⁺, str^r (str^r - устойчивость к стрептомицину).

Для выделения рекомбинантов используют солевую среду М-9 со стрептомицином, содержащую глюкозы 1, 0 г; стрептомицина – 200 ед/мл; NH₄Cl – 1, 0 г; NaС1 – 0, 5 г; Na₂HРO₄ – 6, 0 г; КH₂PO₄– 3, 0 г; Mg₂SO₄– 0, 2 г; дистиллированной воды – 1, 0 л. Для тех же целей может быть использована плотная среда. В этом случае к указанному составу добавляется 20, 0 г агар-агара.

На этой среде могут расти только рекомбинанты (трансконъюганты). Культуры донорного и реципиентного штаммов не растут на данной среде, так как первая ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а вторая ауксотрофна по треонину и лейцину.

Постановка опыта: к 2 мл 3-часовой бульонной культуры реципиента добавляют 1 мл 3-часовой бульонной культуры донора. Смесь инкубируют в течение 30 минут при 37°С. Затем смесь разводят в 100 и 1000 раз и засевают разведения в объеме 0, 1 мл на селективную среду для выделения рекомбинантов. В качестве контроля на такую же среду засевают культуры донора и реципиента в том же объеме. На следующие сутки регистрируют результаты опыта. В пробирках с посевом рекомбинанта наблюдается помутнение среды. В средах с посевами донорной и реципиентной культур роста нет. Аналогичным образом регистрируют результаты посевов на плотных средах.

Просмотреть посевы культур донора, реципиента и рекомбинантов на минимальной среде со стрептомицином. Обратить внимание на рост культуры рекомбинантов. Культуры донора и реципиента не растут на данной среде, так как культура донора ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а культура реципиента ауксотрофна по треонину и лейцину.

Контрольные вопросы

Что такое бактериофаг?

Каковы морфология, размеры и химический состав фагов?

Что содержится в головке бактериофага?

Как устроен хвостик фага и каково его назначение?

Из каких этапов складывается взаимодействие фага с микробной клеткой?

Каким образом фаг вводит свою нуклеиновую кислоту в микробную клетку?

Как осуществляется синтез фаговых частиц внутри микробной клетки?

Какая разница между вирулентным и умеренным фагом?

Что такое лизогения и лизогенная конверсия?

Как выделяют фаги из объектов внешней среды?

Какова методика определения титра фага по Грациа?

Что такое фаготипирование? С какой целью оно применяется?

Что такое ген?

Что таков мутации спонтанные и индуцированные?

Каков молекулярный механизм мутации?

Какие вы знаете мутагены?

Что такое ауксотрофы? Как получают ауксотрофные штаммы бактерий?

Каков механизм генетических рекомбинаций?

Что такое трансформация?

Что такое трансдукция и какими свойствами обладает трансдуцирующий фаг?

Что такое конъюгация бактерий? Как она осуществляется?

Как производят картирование хромосом?

Что такое плазмида?

Какие известны классы плазмид?

Каковы основные свойства плазмид?

Какие существуют типы генетического контроля лекарственной устойчивости у бактерий?

Каковы основные функций F-фактора?

В чем заключается механизм конъюгации бактерий?

Что такое бактериоцины?

Каковы основные свойства Соl -плазмид?

Какими свойствами обладают R-плазмиды?

Как определяют конъюгативные свойства плазмид?

Как получают рекомбинантные молекулы ДНК?

Что такое генетический вектор?

Как у бактерий можно обнаружить плазмиды?

В каких направлениях могут быть использованы достижения генной инженерии?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 7.

Определение понятия ген

Ген – универсальная организующая структурная единица живой материи, которая благодаря содержащейся в ней закодированной информации обеспечивает единство и многообразие всех форм существования жизни, ее непрерывность и эволюцию.

Ген – основной носитель и хранитель жизни, а его продукт – белок – способ её существования.

⇐ Предыдущая 1 234 5 6 7 8 9 10 Следующая ⇒