Цветные реакции на белки и аминокислоты.

⇐ ПредыдущаяСтр 5 из 10Следующая ⇒

Белки - полимерные соединения, построенные из аминокислот, которые соединены между собой пептидными связями.Аминокислоты – это производные карбоновых кислот, у которых три валентности a – углеродного атома всегда заняты одним атомом водорода (-Н), аминогруппой (-NН₂) и карбоксильной группой (-СООН).

Четвёртая валентность может быть занята атомом водорода (глицин) или группировкой атомов, называемой радикалом (-R).

В составе радикалов многие аминокислоты имеют реакционно-способные (функциональные) группы, например сульфгидрильную –SH (цистеин), тиометильную –S- СН₃ (метионин), гидроксильную –ОН (серин, треонин, тирозин).

Цель работы - провести цветные реакции с двумя растворами (I и II), один из которых содержит овальбумин (яичный белок), а другой желатину (овальбумин содержит все 20 аминокислот, а желатина только 17), и определить, в каком растворе овальбумин, а в каком – желатина.

Принцип метода. Ряд химических реактивов специфически взаимодействуют с функциональными группами аминокислот (как свободных, так и в составе пептидов или белков), в результате чего развивается специфическое окрашивание. Такие реакции называют цветными реакциями. Интенсивность окраски в цветных реакциях пропорциональна количеству реагирующих функциональных групп. Поэтому цветные реакции могут быть использованы для качественного и количественного определения белков, для определения присутствующих в них аминокислот или для анализа состава белков.

Например:

- с помощью биуретовой реакции определяют наличие пептидных групп в олигопептидах и в белках (универсальная реакция для любых белков);

- с помощью нингидриновой реакции определяют наличие a-аминогруппв свободных аминокислотах, а также в аминокислотах олигопептидов и белков (универсальная реакция для любых белков);

- с помощью ксантопротеиновой реакции определяют наличие в белках ароматических аминокислот;

- с помощью реакции Фоля определяют наличие аминокислоты - цистеина.

Ход определения

Реакция	Номер пробирки	Ход работы	Окраска	Чем обусловлена
Биуретовая		Раствор I - 5капель, 10%-ный раствор NaOH - 5 капель, 1%-ный раствор СuSО₄- 1 капля
	Раствор II - 5капель, 10%-ный раствор NaOH - 5 капель, 1%-ный раствор СuSО₄- 1 капля
Нингидриновая		Раствор I - 5капель, 1%-ный раствор нингидрина в ацетоне- 2 капли; нагревают
	Раствор II - 5капель, 1%-ный раствор нингидрина в ацетоне- 2 капли; нагревают
Ксантопротеиновая		Раствор I - 5капель, HNO_3(конц.)- 3 капли; осторожно нагревают
	Раствор II - 5капель, HNO_3(конц.)- 3 капли; осторожно нагревают
Фоля		Раствор I - 5капель, , 30%-ный раствор NaOH - 5 капель, 5%-ный раствор(СН₃СОО)₂Рb-1 капля; нагревают до кипения
	Раствор II - 5капель, 30%-ный раствор NaOH - 5 капель, 5%-ный раствор (СН₃СОО)₂Рb-1 капля; нагревают до кипения

Реакция

Номер пробир-ки

Ход работы

Окраска

Чем обуслов-лена

Тема 1.3. Структура и свойства ферментов.

Кинетика ферментативных реакций.

План изучения темы

1. Химическая природа и биологическая активность ферментов.

2. Специфичность действия ферментов. Виды специфичности.

3. Активный центр фермента.

4. Особенности ферментативного катализа. Механизм действия ферментов.

5. Факторы, влияющие на активность ферментов (концентрация субстрата, температура, pH).

Вопросы для самоконтроля.

1. Как называются специализированные белки, обладающие каталитической активностью?

2. Какова биологическая роль ферментов?

3. Приведите доказательства белковой природы ферментов.

4. Назовите общие признаки, присущие биологическим и неорганическим катализаторам.

5. Назовите признаки фермента, принципиально отличающие его от небиологических катализаторов.

6. Нарисуйте график изменения свободной энергии в ходе химической реакции, катализируемой и некатализируемой ферментами.

7. Назовите виды специфичности ферментов?

8. Приведите пример ферментов, обладающих абсолютной субстратной специфичностью действия.

9. Приведите пример ферментов, обладающих относительной субстратной специфичностью действия.

10. Приведите пример ферментов, обладающих стереохимической субстратной специфичностью.

11. На какие группы по строению делятся ферменты?

12. Приведите примеры простых ферментов.

13. Приведите примеры сложных ферментов.

14. Из каких двух частей состоит молекула сложного фермента?

15. Как называется природный комплекс белкового и небелкового компонента фермента?

16. Как называется белковая часть холофермента?

17. Перечислите основные функции апофермента в катализе.

18. Как называется небелковая часть холофермента, прочно связанная с апоферментом?

19. Как называется небелковая часть холофермента, непрочно связанная с апоферментом?

20. Что такое активный центр фермента? Закономерности его построения.

21. Какова роль ионов металла в каталитической активности фермента?

22. Чему равна удельная активность фермента, что она показывает?

23. Нарисуйте график зависимости ʋ от t.

24. Чему равен температурный оптимум для большинства ферментов человеческого организма?

25. Нарисуйте график зависимости скорости ферментативной реакции от рН среды.

26. Что такое оптимум рН фермента?

27. Какой оптимум рН у:

1. Амилазы слюны

2. Пепсина

3. Химотрипсина

28. Нарисуйте график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации фермента.

29. Напишите математическое выражение зависимости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

30. Нарисуйте график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

31. Что такое константа Михаэлиса? Какие свойства фермента характеризуются константой Михаэлиса? Чему она численно равна?

32. Какие принципы положены в основу классификации ферментов?

33. Перечислите 6 классов ферментов.

34. Какой тип реакции катализируют оксидоредуктазы?

35. Какой тип реакций катализируют трансферазы?

36. Какой тип реакций катализируют лиазы?

37. Какой тип реакций катализируют лигазы?

38. Какой тип реакций катализируют изомеразы?

39. Какой тип реакций катализируют гидролазы?

40. Назовите коферменты, которые входят в состав дегидрогеназ.

41. Перечислите основные подклассы гидролаз.

42. Какую функцию выполняют коферменты дегидрогеназ?

43. Назовите витамины, активной формой которых является НАД.

44. Назовите витамин, активной формой которого является ФАД.

Задания, обязательные для выполнения

в процессе самоподготовки

1. 1. Заполните таблицу

Коферменты - производные водорастворимых витаминов

Витамин	Коферментная форма	Тип катализируемой реакции	Примеры ферментативных реакций
Тиамин Рибофлавин
Витамин	Коферментная форма	Тип катализируемой реакции	Примеры ферментативных реакций
Пантотеновая кислота Амид никотиновой кислоты Пиридоксин Фолиевая кислота Биотин Витамин С Витамин B₁₂

2. На графике зависимости скорости реакции от температуры обозначьте процессы:

V 3

1 4

10 20 30 40 50 60

3. Фермент трипсин способен расщеплять пептидные связи белков. Почему обработка трипсином приводит к инактивации многих ферментов?

Для обоснования ответа вспомните:

1. Что такое ферменты?

2. К какому классу ферментов относится трипсин?

4. Сравните специфичность действия двух групп пептидаз – пищеварительного тракта и свертывающей системы крови. В каком случае специфичность выше?

Для обоснования ответа вспомните:

1. Что такое пептидазы, к какому классу они относятся?

2. Что такое специфичность фермента?

Примеры тестовых заданий

1. Общее свойство ферментов и неорганических катализаторов

1. Белковая природа

2. Высокая субстратная специфичность

3. Способность не изменяться в ходе реакции.

2. Белковая часть фермента называется

1. Апофермент

2. Изофермент

3. Простетическая группа

3. Субстратная специфичность фермента определяется

1. Апоферментом

2. Коферментом

3. Углеводными молекулами, присоединёнными к белку.

4. Небелковая часть фермента называется

1. Холофермент

2. Кофермент

3. Апофермент

5. Скорость ферментативной реакции зависит от

1. Концентрации субстрата

2. Концентрации фермент – субстратного комплекса

3. АТФ

6. Зависимость скорости ферментативной реакции выражается уравнением

1. Менделеева – Клайперона

2. Михаэлиса – Ментен

3. Уравнением Ньютона

4. Уравнением Лайнуивера – Бэрка

7. Специфичность сложных ферментов определяется

1. Коферментом

2. Апоферментом

3. Аллостерическим эффектором.

4. Всеми перечисленными факторами

8. Скорость ферментативной реакции повышается

1. При уменьшении температуры

2. При увеличении количества субстрата

3. При денатурации фермента

4. При недостатке кофермента

9. Если концентрация субстрата равна Km, то скорость реакции составляет

1. 0, 25 Vmax

2. 0, 33 Vmax

3. 0, 5 Vmax

4. 0, 67 Vmax

5. 0, 75 Vmax

10. Ферменты увеличивают скорость реакции

1. Повышая энергию активации

2. Уменьшая изменения свободной энергии в ходе реакции

3. Понижая энергию активации реакции

4. Изменяя константу равновесия реакции

Примеры ситуационных задач

(обязательные для решения)

Задача №1

Аппликации протеолитических ферментов (трипсина, химотрипсина) используют для обработки корневых каналов при периодонтите. Объясните механизм действия ферментов и целесообразность данного назначения.

Для обоснования ответа вспомните:

1. Виды специфичности трипсина и химотрипсина.

2. Механизм действия ферментов.

Задача №2

У человека температура поддерживается на постоянном уровне. В медицине используют в ряде случаев экстремальные температуры. Гипотермические условия используют при операциях на головном мозге, сердце, гипертермические условия используются с целью коагуляции тканей. Дайте объяснения правильности таких подходов с точки зрения энзимолога.

Для обоснования ответа вспомните:

1. Что такое температурный оптимум фермента?

2. Как влияют низкие температуры на активность ферментов?

3. Как изменяется метаболизм в клетке при понижении температуры?

Задача №3

Оптимальными условиями действия амилазы – фермента, расщепляющего крахмал, являются рН=6, 8; температура 37º С.

1. Как изменится активность фермента при изменении условий реакции?

а) рН инкубационной среды =5;

б) температура инкубации 70º С;

в) при добавлении в инкубационную среду СuS0₄;

г) при увеличении концентрации крахмала в присутствии СuS0₄ в инкубационной среде.

Для обоснования ответа вспомните:

1. Понятие оптимум pH.

2. Температурный оптимум действия ферментов.

Задача №4

Раствор, содержащий высокомолекулярные вещества различной природы (полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты), проявляет каталитическую активность по отношению к какой-либо определенной реакции. Природа катализатора неизвестна. Установлено, что он обладает следующими свойствами:

а) снижает энергию активации;

б) ускоряет прямую и обратную реакции;

в) обладает высокой специфичностью;

г) ускоряет момент достижения равновесия, не сдвигая его;

д) прекращает каталитическое действие после добавления в раствор вещества, разрушающего пептидные связи. Какие из свойств служат прямым доказательством белковой природы катализатора?

Для обоснования ответа вспомните:

1. Признаки биологических катализаторов.

2. Признаки, отличающие биологические катализаторы от небиологических.

Водорастворимые витамины

Название	Суточная потребность, мг	Кофер- ментная форма	Биологические функции	Характерные признаки авитаминозов
В₁(тиамин)	2-3	ТДФ	Декарбоксилирование а-кетокислот, перенос активного альдегида (транскетолаза)	Полиневрит
В₂(рибофлавин)	1, 8-2, 6	FAD FMN	В составе дыхательных ферментов, перенос водорода	Поражение глаз (кератиты, катаракта)
B₅ (пантотеновая кислота)	10-12	KoA-SH	Транспорт ацильных групп	Дистрофические изменения в надпочечниках и нервной ткани
Название	Суточная потребность, мг	Коферментная форма	Биологические функции	Характерные признаки авитаминозов
В₆ (пиридоксин)	2-3	ПФ (пиридоксаль-фосфат)	Обмен аминокислот (трансаминирование, декарбоксилирование)	Повышенная возбудимость нервной системы, дерматиты
PP(ниацин)	15-25	NAD NADP	Акцепторы и переносчики водорода	Симметричный дерматит на открытых участках тела, деменция и диарея
Н(биотин)	0, 01-0, 02	Биотин	Фиксация СО₂, реакции карбоксилирования (например, пирувата и ацетил-КоА)	Дерматиты, сопровождающиеся усиленной деятельностью сальных желёз
В_c(фолиевая кислота)	0, 05-0, 4	Тетрагидро-фолиевая кислота	Транспорт одноуглеродных групп	Нарушения кроветворения (анемия, лейкопении)
В₁₂ (кобаламин)	0, 001-0, 002	Дезоксиаденозил и метил- кобаламин	Транспорт метальных групп	Макроцитарная анемия
С(аскорбиновая кислота)	50-75	_	Гидроксилирование пролина, лизина (синтез коллагена), антиоксидант	Кровоточивость дёсен, расшатывание зубов, подкожные кровоизлияния, отёки
Р(рутин)	Не установлена	_	Вместе с витамином С участвует в окислительно-восстановительных процессах, тормозит действие гиалуронидазы	Кровоточивость дёсен и точечные кровоизлияния

Лабораторная работа

Специфичность действия амилазы (α -1, 4-глюкан-4-глюкангидролаза) и сахаразы (β -D-фруктофуранозид-фруктогидролаза)

Принцип метода. Метод основан на сравнительном изучении гидролиза α -амилазой и сахаразой разных субстратов, содержащих глюкозидные связи: крахмала и сахарозы. Гидролиз крахмала и сахарозы оценивают пробой Фелинга на восстанавливающие сахара (мальтоза, глюкоза).

Ферменты катализируют реакции по схеме:

α -амилаза

Крахмал + nH₂O → Декстрины + Мальтоза → Глюкоза

сахараза

Сахароза + H₂O → Глюкоза + Фруктоза

Ход определения. В одну пробирку вносят 10 капель раствора крахмала, в другую – такой же объем раствора сахарозы. Для выявления специфичности α -амилазы в обе пробы добавляют по 5 капель разбавленной слюны, перемешивают встряхиванием и ставят в водяную баню при 38˚ С на 10 мин. Затем с жидкостью в обеих пробирках проделывают пробу с реактивом Фелинга (1 капля CuSO4 + 5кап. NaOH, пробы нагревают на спиртовке) и сравнивают окраску.

Оформление работы. Данные занести в таблицу, сделать вывод о специфичности изученных ферментов.

Фермент	Субстрат	Проба с реактивом Фелинга	Специфичность действия

Практическое значение работы. Ферменты с абсолютной и относительной групповой субстратной специфичностью, обладающие меньшей избирательностью действия на субстраты, участвуют, как правило, в гидролизе питательных веществ или превращении чужеродных соединений. В частности, α -амилаза и сахараза проявляют специфичность не к структуре субстрата в целом, а к типу гликозидных связей, находящихся в соответствующих углеводах.

Амилаза гидролизует 1, 4-гликозидные связи в молекуле крахмала, но не действует на 1, 2-гликозидные связи в молекуле сахарозы.

⇐ Предыдущая 1 2 3 456 7 8 9 10 Следующая ⇒