Химической посудой и вспомогательными приспособлениями

Для выполнения методик

7.1. Стеклянная химическая посуда (пробирки, пипетки, колбочки, мерные цилиндры и др.) требует осторожного обращения. В противном случае она может разбиться и травмировать осколками стекла работающего и окружающих.

7.2. Автоматические пипетки должны находиться в штативах-подставках. Пластик, из которого они сделаны, достаточно хрупкий, при неосторожном обращении, ударах эти точные измерительные приборы могут быть выведены из строя.

 

Дата: __________________

 

ЗАНЯТИЕ № 1

РАБОТА № 1. КОЛОРИМЕТРИЯ, ОБЩИЙ ПРИНЦИП. УСТРОЙСТВО ФОТОЭЛЕКТРОКОЛОРИМЕТРА

Колориметрическим методом определяют концентрацию веществ в окрашенных прозрачных растворах по интенсивности окраски раствора. В основу колориметрического метода анализа положен закон Ламберта-Бугера-Бера: поглощение света прямопропорционально концентрации вещества в растворе и зависит от толщины слоя (толщине кювет, d). В фотометрии используют монохроматический свет (свет определенной длины волны, l).

 

Принципиальная схема устройства фотоэлектроколориметра

 

Расчет концентрации вещества.

 

1. по формуле (с использованием стандартного раствора, с известной концентрацией вещества)

 

 

 

Где С_о – концентрация опытной пробы.

Е_о – экстинкция опытной пробы.

С_ст - концентрация стандартной пробы.

Е_ст - экстинкция пробы со стандартным раствором.

 

 

2. По калибровочному графику, который строят, используя стандартные растворы, содержащие различные известные концентрации вещества и сопутствующие им показания оптической плотности.

 

 

 

Дата: ________________

ЗАНЯТИЕ № 2

РАБОТА № 1. ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ

Обоснование выполнения работы: цветные реакции на белки и аминокислоты позволяют обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях, установить аминокислотный состав. Эти реакции применяют как для качественного, так и для количественного определения белков и аминокислот.

 

1. Биуретовая реакция на белки.

 

Принцип метода: раствор белка в щелочной среде в присутствии сульфата меди (NaOH/CuSO₄) окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Окраска определена образованием комплексного соединения ионов меди с пептидными группами белка, которых должно быть не менее двух. Таким образом, эта реакция открывает все белки, а также низкомолекулярные пептиды.

Ход работы: взять опытную пробирку.

 

ОТМЕРИТЬ	О П Ы Т
Раствор белка NaOH, 10 % CuSO4, 1 %	5 капель 5 капель 2 капли

 

РЕЗУЛЬТАТ:

 

 

В Ы В О Д:

 

 

2. Нингидриновая реакция.

 

Принцип метода: аминокислоты, пептиды и белки при кипячении с раствором нингидрина дают синее окрашивание (комплекс Руэмана). Реакция характерна для аминогрупп, находящихся в альфа-положении.

 

СО₂

АМИНОКИСЛОТА + НИНГИДРИН ® ШИФФОВО ОСНОВАНИЕ

 

 

АЛЬДЕГИД

АМИНОДИКЕТОГИДРИНДЕН + НИНГИДРИН КОМПЛЕКС РУЭМАНА (СИНЕ-ФИОЛЕТОВОГО ЦВЕТА)

 

Ход работы: взять опытную пробирку.

 

ОТМЕРИТЬ	О П Ы Т
Раствор белка Нингидрин 0, 5 %	5 капель 5 капель

 

РЕЗУЛЬТАТ:

 

В Ы В О Д:

 

 

3. Ксантопротеиновая реакция Мульдера

(на ароматические аминокислоты).

 

NO₂

t ⁰100C

HO― ― CH₂― CH― COOH + 2HNO₃ → HO― ― CH₂― CH― COOH

│ │

NH₂ NO₂ NH₂

 

тирозин динитротирозин

 

Принцип метода: ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан) при нагревании с азотной кислотой нитруются. Это проявляется развитием желтого окрашивания.

Ход работы: взять опытную пробирку.

 

ОТМЕРИТЬ	О П Ы Т
раствор белка   HNO3 концентрированная	5 капель 5 капель
Кипятить (1000 С) до появления окраски

 

РЕЗУЛЬТАТ:

 

В Ы В О Д:

 

4. Реакция Фоля на цистеин.

Принцип метода: реакция характерна для слабосвязанной серы в составе аминокислоты цистеин. Конечный продукт – сульфид свинца – черного цвета.

2Н₂О

ЦИСТЕИН + 4NaOH + (СН₃СОО)₂ Рb СЕРИН + РbS + 4NaOH + 2CH₃COOH ацетат свинца сульфид

свинца

 

Ход работы: взять пробирку:

 

ОТМЕРИТЬ	О П Ы Т
Раствор белка NaOH, 30 % Раствор (СН3СОО)2 Рb 5 %	5 капель 5 капель 1 каплю
Кипятить до появления окраски.

 

РЕЗУЛЬТАТ:

 

 

В Ы В О Д:

 

РАБОТА № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА ПЛАЗМЫ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Принцип метода: БЕЛОК + NaOH/CuSO₄ = сине-фиолетовый цвет, интенсивность окраски раствора прямо-пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически.

 

Ход работы: взять две пробирки: контрольную и опытную.

 

ОТМЕРИТЬ	КОНТРОЛЬ	О П Ы Т
Реактив Горнала сыворотка NaCl 0, 9 %	4, 0 мл - 0, 1 мл	4, 0 мл 0, 1 мл -
Перемешать, фотометрия через 20 минут. Кювета 10мм, l = 540 нм (зеленый светофильтр)

 

РЕЗУЛЬТАТ: Измерение на колориметре проводят против контрольной пробы и отмечают экстинцию. Ex₀ =

 

Конечный результат: определяют по калибровочному графику.

 

Co = г/л

 

 

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Нормальное содержание общего белка (общий белок крови = альбумины + глобулины + фибриноген) в сыворотке крови у взрослых - 65-85 г/л.

Повышение концентрации общего белка сыворотки крови (гиперпротеинемия) характерно для: ревматоидного артрита, коллагенозов, бронхоэктатической болезни, миеломной болезни, гипериммуноглобулинемии, а также гипогидратации организма (рвота, понос) и венозного стаза;

Снижение концентрации белка в сыворотке крови (гипопротеинемия) отмечается при: голодании, беременности, нефротическом синдроме (гломерулонефрит), хронических заболеваниях печени (гепатиты и циррозы), гастроэнтеропатиях, ожогах, раковой кахексии.

 

ВЫВОД:

 

 

Дата: ________________

ЗАНЯТИЕ № 3

РАБОТА № 1. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ КОНЦЕНТРИРОВАННЫМИ МИНЕРАЛЬНЫМИ КИСЛОТАМИ

 

Обоснование выполнения работы: демонстрируют влияние химических факторов на устойчивость белков в растворах.

 

Принцип метода: белок осаждается вследствие химической денатурации белка и образования комплексной соли белка с кислотами.

 

Ход работы: взять опытную пробирку:

 

 

ОТМЕРИТЬ	ОПЫТ
HNO3 концентрированная   Раствор белка	10 капель -   10 капель

 

Наклонив пробирки под углом 45^о, осторожно по стенке пробирки приливают раствор белка так, чтобы обе жидкости не смешивались.

 

РЕЗУЛЬТАТ:

 

В Ы В О Д:

 

 

РАБОТА № 2. РАЗДЕЛЕНИЕ АЛЬБУМИНОВ И ГЛОБУЛИНОВ ЯИЧНОГО БЕЛКА МЕТОДОМ ВЫСАЛИВАНИЯ

 

Обоснование выполнения работы: высаливанием обратимо осаждают белки, фракционируют их. Используют для выделения белков, в том числе ферментов.

Принцип метода: при высаливании происходит дегидратация макромолекул белка и устранение заряда. Осаждение белка обратимо и зависит от молекулярной массы белка и дегидратирующей способности растворов нейтральных солей.

 

Ход работы: взять две пробирки: опыт 1 и опыт 2

 

ОТМЕРИТЬ	ОПЫТ 1	ОПЫТ2
Раствор белка NaCl (порошок)   (NH4)2SO4-насыщенный раствор (100 %)	1, 0 мл до насыщения (100%) -     Отставить на 10 минут	1, 0 мл -   1, 0 мл (получится 50% раствор)   Без инкубации
Р Е З У Л Ь Т А Т:
	Отфильтровать	Отфильтровать
(NH4)2 SO4 (порошок)	Прокипятить	Добавить соль до насыщения
Р Е З У Л Ь Т А Т:

 

 

В Ы В О Д:

 

 

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 4

РАБОТА № 1. КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ

 

Обоснование выполнения работы: гидролиз белка – это расщепление биополимера с присоединением воды по месту разрыва пептидных связей под действием кислот, оснований или протеаз. Последовательность гидролиза белка показана на схеме.

В лабораторных условиях гидролиз белков используется для определения первичной структуры, аминокислотного состава белков. Гидролизаты белков применяются в качестве лечебных препаратов при парентеральном питании. В организме человека и животных постоянно происходит гидролиз белков в пищеварительном тракте и клетках органов под действием протеолитических ферментов.

 

Принцип метода: большинство биополимеров в реакциях с водой распадаются на мономеры. Гидролиз катализируют протоны, ионы гидроксила и ферменты по механизму нуклеофильного замещения у углерода с карбонильной группой. Полный кислотный гидролиз белков при кипячении происходит в течение 12-96 часов.

 

 

Ход работы:

 

1. В химическую колбу внести 20 мл раствора яичного белка.

 

¯

 

2. Добавить 5 мл концентрированной НCl

 

¯

 

3. Отливают 0, 5 – 1 мл смеси в пробирку ( № 1), (5 капель)

¯

 

4. Колбу закрывают резиновой пробкой с длинной стеклянной трубкой (обратный холодильник)

 

¯

 

5. Содержимое колбы кипятить под вытяжкой в течение 45 минут

 

¯

 

6. После охлаждения отливают 0, 5 – 1 мл гидролизата в пробирку ( № 2) (5 капель)

 

¯

 

7. Нейтрализуют содержимое пробирок 20 % NaOH по лакмусу до голубой окраски

 

¯

 

8. Проводят биуретовую реакцию в пробирках № 1 и № 2.

 

РЕЗУЛЬТАТ:

 

В Ы В О Д:

 

 

РАБОТА № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТРИПСИНА

 

Обоснование выполнения работы: протеолитический фермент трипсин осуществляет расщепление пищевых белков в содержимом двенадцатиперстной кишки в верхних отделах тонкого кишечника. Фермент используется также для расщепления белков в лабораторных условиях.

 

Принцип метода: протеолитическая активность трипсина регистрируется по количеству освобождающегося аргинина и лизина, которые с фенольным реактивом дают синюю окраску, измеряемую колориметрически.

Ход работы: взять две центрифужные пробирки: контрольную и опытную.

ОТМЕРИТЬ	КОНТРОЛЬ	О П Ы Т
Раствор белка Фосфатный буфер рН-8, 0 ТХУ, 10 % Раствор трипсина	0, 5 мл   1, 0 мл 2, 0мл 0, 5 мл	0, 5 мл   1, 0 мл - 0, 5 мл
Инкубация 20 минут, при 37о С в термостате
ТХУ, 10 %		2 мл
Центрифугирование 10 минут, 1500 об/мин. Центрифугат перелить в сухие пробирки.
раствор NaOH 0, 5 М фенольный реактив	5, 0 мл 0, 5 мл	5, 0 мл 0, 5 мл
Размешать. Инкубация 20 минут при 18о С

 

РЕЗУЛЬТАТ:

 

В Ы В О Д:

 

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 5

 

РАБОТА № 1. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ: позволяет охарактеризовать одно из свойств ферментов – зависимость протекания ферментативных реакций от температуры (термолабильность).

 

Принцип метода:

амилаза амилаза

Крахмал ---------® декстрины ------------® мальтоза.

 

Крахмал дает с иодом синий цвет.

Декстрины дают с иодом фиолетовое, красно-бурое окрашивание.

Мальтоза – желтый (цвет иода в воде).

 

ХОД РАБОТЫ: взять четыре пробирки, опыт 1-4. Развести слюну 1: 10. (1мл слюны в отдельной пробирке + 9мл Н₂О)

 

ОТМЕРИТЬ	ОПЫТ-1	ОПЫТ-2	ОПЫТ-3	ОПЫТ-4
Крахмал 1 % Амилаза слюны Разведение (1: 10)	0, 5 мл 0, 5 мл	0, 5 мл 0, 5 мл	0, 5 мл 0, 5 мл	0, 5 мл 0, 5 мл
Поместить пробирки на 10 минут	Лед (0оС)	Комнатная оС (20оС)	Термостат (40оС)	Кипящая баня (100оС)
Через 10 минут во все пробирки добавить по 1-2 капли KJ 1%

 

РЕЗУЛЬТАТ:

 

ВЫВОД:

 

РАБОТА № 2. ВЛИЯНИЕ АКТИВАТОРОВ И ИНГИБИТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

 

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ: активаторы и ингибиторы регулируют действие ферментов. Эти сведения используют для изучения влияния ксенобиотиков и изучения воздействия на энзимы изменяющихся концентраций нормальных метаболитов клетки.

 

Принцип метода: При активации идет конформационная перестройка активного центра фермента и увеличивается скорость реакции. Ингибиторы оказывают противоположное действие (механизмы различны: через аллостерический центр, путем ковалентного связывания, денатурации и т.д.).

ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки: контрольную и две опытные.

 

ОТМЕРИТЬ	КОНТРОЛЬ	ОПЫТ 1	ОПЫТ 2
Н20 NaCl 1 % CuSO4 1 % Амилаза слюны (1: 10) Крахмал 1%	10 капель - - 20 капель 5 капель	8 капель 2 капли - 20 капель 5 капель	8 капель - 2 капли 20 капель 5 капель

¯

Пробирки оставить при комнатной температуре на 5 минут

(10, 15 минут).

¯

Добавляют по 2-3 капли раствора йода во все пробирки.

 

РЕЗУЛЬТАТ:

 

 

ВЫВОД:

 

РАБОТА № 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ (ДИАСТАЗЫ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И МОЧЕ

ПО МЕТОДУ КАРАВЕЯ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ: определение активности амилазы в моче и сыворотке крови используют для диагностики заболеваний поджелудочной железы.

 

Принцип метода: метод основан на колориметрическом определении концентрации крахмального субстрата до и после его ферментативного гидролиза. Степень расщепления крахмала оценивается пробой с 0, 01 н раствором йода.

 

ХОД РАБОТЫ:

 

ОТМЕРИТЬ	ОПЫТ	КОНТРОЛЬ
Раствор стойкого крахмального субстрата	0, 5 мл	0, 5 мл
прогреть 5 мин в термостате при 370 С
Сыворотка крови	0, 01 мл	-
прогреть 5 мин в термостате при 370 С
Рабочий раствор йода (0, 01 Н)	0, 5 мл	0, 5 мл
Вода дистиллированная	4 мл	4 мл
Сыворотка крови	-	0, 01 мл

 

 

Пробирки встряхнуть. Измерение на колориметре опытной и контрольной проб проводят против воды. Длина 630 – 690 нм (красный светофильтр), кювета 1 см.

РАСЧЕТЫ: Расчет активности α -амилазы в граммах расщепленного крахмала на 1 л сыворотки за 1 час инкубации при 37⁰ С производят по формуле

Е_к – Е_оп

Х = -------------------- х 240

Е_к

Е_к - экстинкция контрольной пробы,

Е_оп – экстинкция опытной пробы.

 

РЕЗУЛЬТАТ:

 

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Активность α -амилазы в сыворотке крови в норме = 16 – 30 г/час/л, в моче – 28 – 160 г/час/л.

Повышение активности фермента наблюдается при: паротите, панкреатите, раке поджелудочной железы, перитоните, циррозе печени, остром инфекционном гепатите, внематочной беременности, диабетическом кетоацидозе.

Снижение активности α -амилазы отмечается при: атрофии поджелудочной железы, нарушении фильтрационной функции почек, кахексии.

ВЫВОД:

 

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 6

 

⇐ Предыдущая1234567Следующая ⇒

Поделиться: