РАБОТА № 1. КИНЕТИКА ДЕЙСТВИЯ ЛИПАЗЫ. ВЛИЯНИЕ ЖЕЛЧИ НА АКТИВНОСТЬ ЛИПАЗЫ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ: липолитические ферменты поджелудочной железы гидролизуют жиры пищи в тонком кишечнике. Желчные кислоты эмульгируют жиры, активируют липазу и участвуют во всасывании продуктов переваривания липидов. Изучая кинетику действия липазы можно проследить в динамике активность фермента и обозначить факторы, влияющие на этот процесс (температура, концентрация субстрата и продуктов реакции, желчь).

ПРИНЦИП МЕТОДА: липаза катализирует реакцию:

 

Липаза

Триацилглицерол-------------® глицерол + жирные кислоты

+НОН

 

О

СН₂ – О – С

R₁ СН₂ – ОН R₁ – COOH

О липаза │

СН – О – С --------® СН – ОН + R₂ – COOH

R₂ НОН │

О СН₂ – ОН R₃ – COOH

СН₂ – О – С

R₃

Скорость действия липазы можно определить по количеству жирных кислот, образующихся за определенный промежуток времени. Количество жирных кислот определяют титрованием щелочью с индикатором фенолфталеином и выражают в мл 0, 01 н раствора щелочи.

 

ХОД РАБОТЫ: взять две большие пробирки: опыт 1 и опыт 2

 

ОТМЕРИТЬ	ОПЫТ-1 (без желчи)	ОПЫТ-2 (с желчью)
Молоко (1: 10) Н2О Раствор желчи Липаза из поджелудочной железы	10, 0 мл 1, 0 мл - 1, 0 мл	10, 0 мл - 1, 0 мл 1, 0 мл
	Перемешать и поместить в термостат при 38оС. Взять по 2 мл в колбочки + 1-2 капли фенолфталеина, титровать 0, 01 н NaOH до розовой окраски.

 

При первом титровании нейтрализуют кислоты, присутствующие в молоке до начала действия липазы.

Результаты первого титрования (до начала действия липазы) вычитают из результатов последующих титрований, которые проводят через 15, 30 и 45 минут.

 

Время инкубации, мин.	Объем 0, 01 н раствора NaOH, пошедшего на титровние
Результат 0 определения: 15	Х Y – X = D Y Z – X = D Z E – X = D E	Без желчи	С желчью

РЕЗУЛЬТАТ: данные титрования записать в таблицу.

 

 

КОНЕЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ: полученные данные используют для построения графика.

 

Кинетика действия липазы:

V_мл NaOH

0, 01 н

время (мин)

15 30 45

 

ВЫВОД:

 

 

Дата_________________

ЗАНЯТИЕ № 7

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ АУДИТОРНАЯ РАБОТА

ПО ТЕМЕ «БЕЛКИ, ФЕРМЕНТЫ»

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 9

 

РАБОТА № 1. ГИДРОЛИЗ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ ДРОЖЖЕЙ

 

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ: кислотный гидролиз используется для изучения химического состава нуклеопротеидов.

ПРИНЦИП МЕТОДА:

СХЕМА ГИДРОЛИЗА НУКЛЕОПРОТЕИДОВ

НУКЛЕОПРОТЕИДЫ (дрожжи)

H₂SO₄ 10%

100^oC

 

БЕЛОК НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

(протамины или гистоны) (ДНК, РНК)

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ

ПОЛИПЕПТИДЫ ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ

 

ТРИ-, ДИПЕПТИДЫ

 

СВОБОДНЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ МОНОНУКЛЕОТИДЫ

 

 

НУКЛЕОЗИДЫ ФОСФОРНАЯ

КИСЛОТА

 

ПУРИНОВЫЕ ДЕЗОКСИРИБОЗА

ИЛИ ПИРИМИДИНОВЫЕ ИЛИ РИБОЗА

АЗОТИСТЫЕ ОСНОВАНИЯ

 

Продукты гидролиза открывают специфическими реакциями: полипептиды – биуретовой реакцией; пуриновые основания – серебряной пробой (серебряные соли пуринов образуют светло-коричневый осадок), пентозы – пробой Троммера (возникает красное окрашивание вследствие окисления рибозы), фосфорную кислоту – молибденовой пробой (образуется фосфорномолибденовокислый аммоний – желтый кристаллический осадок).

 

ХОД РАБОТЫ: взять колбу, внести 5 г дрожжей + 40 мл 10%-го раствора H₂SO₄, закрыть пробкой со стеклянной трубкой и поставить для кипения (100^оС) на 60 минут.

Через час охладить и отфильтровать.

В фильтрате открывают продукты гидролиза.

Взять четыре пробирки и в каждой выполнить реакцию:

 

	ОТМЕРИТЬ	ОПЫТ
1. БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ	Гидролизат NaOH 10% CuSO4 1 %	5 капель 10 капель 1 - 2 капли
Возникает фиолетовое окрашивание
2. СЕРЕБРЯНАЯ ПРОБА НА ПУРИНЫ	Гидролизат (NH4)OH конц. AgNO3 1 %	10 капель 1 каплю 5 капель
Оставить на 5 мин	Образуется светло-коричневый осадок.
3. ПРОБА ТРОММЕРА НА РИБОЗУ И ДЕЗОКСИРИБОЗУ	Гидролизат NaOH 30 % CuSO4 7 %	5 капель 10 капель 3 капли
Нагреть, до начала кипения, выпадает красный осадок Cu2O или желтый CuOH
4. МОЛИБДЕНОВАЯ ПРОБА НА ФОСФОРНУЮ КИСЛОТУ	Молибденовый реактив Гидролизат	20 капель   5 капель
	Кипятить несколько минут, получается окраска лимонно-желтого цвета.

 

РЕЗУЛЬТАТ:

 

ВЫВОД:

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 10

 

РАБОТА № 1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЧЕВОЙ КИСЛОТЫ В МОЧЕ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ: мочевая кислота образуется из пуриновых оснований (аденин, гуанин). Выделение мочевой кислоты с мочой зависит от содержания пуринов в пище и от состояния обмена нуклеиновых кислот в организме. Мочевая кислота в виде кислого урата натрия входит в состав подагрических отложений в сухожилиях, хрящах, слизистых оболочках суставных сумок. Метаболит существует в виде 2-х таутомерных форм:

OH O

 

 

C C

 

N C N HN C NH

C-OH C = O

HO - C C N C C NH

H

O

 

N N

H

Енольная форма Кетонная форма

 

ПРИНЦИП МЕТОДА: мочевая кислота в щелочной среде восстанавливает фосфорновольфрамовый реактив, который приобретает интенсивный синий цвет. Количество восстановленного фосфорновольфрамового реактива можно определить (титруя) раствором [K₃Fe(CN)₆]. При этом синий раствор обесцвечивается. Количество использованного K₃[Fe(CN)₆] эквивалентно содержанию мочевой кислоты.

 

 

ХОД РАБОТЫ: взять две пробирки:

 

Отмерить	Стандарт	Опыт
Моча Стандартный раствор мочевой кислоты ( 0, 5 мг/мл) Раствор NaOH – 20 % раствор Фосфорновольфрамовый реактив	-   2, 0 мл 1, 0мл 1, 0мл	2, 0 мл   - 1, 0 мл 1, 0 мл

 

Титрование каждой пробы раствором К₃[Fe(CN)₆] до исчезновения синего цвета.

РЕЗУЛЬТАТ: записать объем K₃[Fe(CN)₆], пошедший на титрование.

 

 

ВЫЧИСЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТА. Пример:

 

На титрование стандарта использовано

2мл K₃[Fe(CN)₆]

На титрование опыта – 3 мл K₃[Fe(CN)₆]

Составляем пропорцию:

1 мг мочевой кислоты - 2 мл

х мг мочевой кислоты - 3 мл

 

3 х 1

2 мл мочи содержит = Х = ----------- = 1, 5

мг/пробе

Суточное выделение мочевой кислоты рассчитывают с учетом суточного диуреза (мужчины –1, 5, женщины – 1, 2 л.).

 

 

ВЫВОД:

 

 

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:

У взрослых здоровых людей с мочой за сутки выделяется 1, 6 – 6, 44 ммоль (0, 3 – 1, 2 г) мочевой кислоты.

Повышенная экскреция мочевой кислоты ( гиперурикурия ) наблюдается при: заболеваниях, сопровождающихся ускоренной гибелью клеток (терапия раковых и лейкозных больных цитостатиками, гемобластозы, гемолитические процессы, псориаз, синдром длительного сдавления), токсикозах беременности, алкоголизации, потреблении богатых пуринами продуктов (печень, почки, икра рыб)

Пониженное выведение мочевой кислоты ( гипоурикурия ) отмечается при: почечной недостаточности, подагре, нефритах, отравлениях свинцом и бериллием, синдроме Дауна.

 

Дата_______________

ЗАНЯТИЕ № 11

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ АУДИТОРНАЯ РАБОТА

ПО ТЕМЕ «БИОСИНТЕЗ БЕЛКОВ»

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 12

 

⇐ Предыдущая1234567Следующая ⇒

Поделиться: