Электрофоретическая подвижность

Подвижность белка в изоэлектрической точке равна нулю. При сдвиге рН на две единицы в любую сторону, подвижность белка становится сравнима с подвижностью малых ионов. Она зависит также от ионной силы и температуры, поэтому о подвижности следует говорить, когда хорошо известны условия среды. Основной причиной различий подвижности является белковый заряд. Но нельзя все сводить только к заряду. Согласно теории Дебая-Хюккеля в растворе электролита каждый заряд экранирован диффузной атмосферой противоионов, плотность которой убывает с расстоянием по закону:

ρ = ρ ₀е^{-æ r},

r – расстояние,

=1/æ – средняя толщина ионной атмосферы.

æ = ,

J = – ионная сила, е – заряд электрона, − число Авогадро, − диэлектрическая проницаемость.

Подвижность сферических частиц, движущихся при электрофорезе, с точностью до коэффициента определяется формулой Смолуховского:

U = ,

- это вязкость среды, - разность потенциала в двойном слое, окружающем частицу.

Рассмотрим два случая:

1) низкие ионные силы (разбавленный раствор электролита): J < < 0, 01.

В этих растворах толщина дебаевской диффузной оболочки больше размеров частиц. При таких условиях:

= , где z - заряд белковой частицы, – ее радиус.

Заряд глобулы пропорционален её поверхности:

z = 4π a²α e, где α е – заряд единицы поверхности. Тогда электрофоретическая подвижность:

U = .

2) ионная сила J 0, 1.

Толщина ионной атмосферы < 10 Å (т. е. меньше размера белковой глобулы < ). Скачок потенциала сосредоточен полностью в слое 1/æ. В этих условиях:

æ ^-1 U = æ ^-1.

В этом случае подвижность не зависит от размера частицы, от молекулярной массы белка. Это ближе к реальным условиям электрофореза белков, который при не слишком низких ионных силах буферных растворов определяется зарядом, но не сильно чувствителен к молекулярным массам и размерам белков.

Конформационные переходы у пептидов

Различить ту или иную структуру белка (α, β или неупорядоченную) сложно. Равновесная конформация в белках обеспечивается взаимодействием боковых групп аминокислотных остатков друг с другом и с растворителем, а с другой стороны - водородными связями между пептидными группами. Роль водородных связей растет в неполярных растворителях и падает в сильнополярных. Сильнополярные растворители сами образуют водородные связи с CO и NH группами пептидных группировок. Если боковые группы заряжены одноименно, то упорядоченность исчезает, а если они не заряжены, то в зависимости от их взаимодействия друг с другом и с растворителем можно наблюдать α, β структуры и стат. клубок. При изменении температуры, рН, состава растворителя обнаруживаются конформационные переходы между этими тремя типами структур. Эти переходы кооперативны и происходят внутри каждой макромолекулы.

Полилизин в заряженном состоянии не образует регулярных структур (β –спиралей) и ведет себя как линейный полиэлектролит. При рН > 10, 5 – разряжен и образует α -спираль, которая устойчива в воде при температуре ниже 20 ⁰С. При нагревании до 20⁰ – 35⁰С молекулы полилизина переходят в состояние статического клубка. При температуре выше 35⁰С наблюдается второй конформационный переход и возникают β -складчатые структуры.

При отливке пленок из растворов, содержащих белки, макромолекулы белков сохраняют ту конформацию, которую они имели в этом растворителе. Структура и упаковка в твердой фазе этих молекул определяется свойствами растворителя, из которого полимер выделяется при испарении жидкости.

 

 

Метод Линдерштрема и Ланга

Большинство методов дают суммарное число аминокислотных остатков в α -спиральных и β -структурных участках макромолекулы, а т.к их различить сложно, то используется понятие степени регулярности структуры белка. По скорости замены атомов водорода (Н) в NH-группах пептидной группировки на Н² или Н³ удобно определять степень регулярности структуры белка. Н¹ в NH-группах обменивается на дейтерий быстро, если полипептид имеет низкую молекулярную массу и если он неупорядочен, и наоборот.

Скорость обмена зависит от условий эксперимента. Переход от быстрого обмена к медленному – признак образования внутримолекулярных водородных связей.

В молекуле РНК-азы из 123 пептидных атомов водорода 70 обмениваются медленно, следовательно, степень регулярности равна 57%. Оказалось, что из этих 70 пептидных групп, стабилизированных водородными связями, 25 способны медленно обмениваться при 0⁰С, еще 25 – при 38⁰С и 20 не обмениваются до 60⁰С. При нагревании возле 60⁰С происходит разрыв водородных связей между пептидными группировками, α -спираль превращается в стат. клубок (денатурация).

 

 

⇐ Предыдущая234567891011Следующая ⇒

Поделиться: