Техника генно-инженерного эксперимента (стадии)

1. Получение ДНК чужеродного фрагмента, который необходимо включить (вклеить) в клетку хозяина. Например, получение ДНК человеческого инсулина.

 

 

Рис.2.

 

2. Получение плазмиды из клетки донора

Есть клетка-реципиет (напр. Е. coli) из которой мы получаем плазмиды - это элементарная концевая молекула ДНК в 100-1000 раз меньше хромосомы, существует в бактериальных клетках или клетках прокариот, плазмиды несут ограниченное количество генов (не более 30).

 

 

Рис.3.

3. Конструирование рекомбинантной плазмиды (вектора)

Вектор – рекомбинат (подготовленная для генно-инженерных манипуляций плазмида или в виде фага или в виде изолированной ДНК или вируса) или часть рекомбинантной ДНК, которая обеспечивает проникновение и дальнейшую репликацию этой ДНК в клетке хозяина. Вектор получают с помощью рестриктазы (разрывает фосфодиэфирные связи в строго определенном месте последовательности оснований нуклнеотидной цепи).

Вероятность передачи молекулы плазмидной ДНК при коньюгации 1 на 1000 или 1 на 10000. Если есть вектор на основе фага или вируса, то он будет более агрессивен и вероятность повышается в 100 – 1000 раз. От вирусной или фаговой информации трудно освободиться. В генной инженерии включение нового гена происходит с помощью фермента рестриктазы.

 

 

Рис.4.

 

Рестриктаз в клетке может быть очень много. Рестриктазы разрушают фосфодиэфирные связи между нуклеотидами в строго определенном месте, т.е. они обладают строгой специфичностью, действуя на определенную последовательность нуклеотидов в цепи. После разрыва связей образуются «липкие концы» и в разрывы включаютсч гены с помощью ферментов ДНК- лигаз, которые соединяют нуклеотиды между собой. Есог 1- рестриктаза действует в строго определенной последовательности на одну нить ДНК. Другая рестриктаза расщепляет вторую нить ДНК на другом участке. Рестриктазы расщепляют ковалентные фосфодиэфирные связи между нуклеотидами. После расщепления связей образуются «липкие концы» и в место разрыва можно включить ген, который «сшивается с ДНК с помощью ДНК-лигаз.

Генному инженеру необходимо для получения рекомбинанта использовать Ecor I, т.к. деятельность BSUR I менее выгодно (шестичастотная последовательность встречается через каждые 44096 раз; четырех частотная последовательность встречается через каждые 250 раз; при более частой последовательности можно изрезать нужный ген ).

Введение фрагмента ДНК (гена человеческого инсулина в плазмиду клетки реципиента (E.coli): 2 липких конца одного биообъкета и 2 липких конца другого комплементарно воссоединились. Ген инсулина является чужеродным, поэтому может иметь место такое явление как отжиг.

 

Рис.5.

 

Отжиг – это процесс смещения двух фрагментов ДНК, когда восстанавливаются только водородные связи и фосфодиэфирные связи не образуются.

Для восстановления фосфодиэфирных связей используют ДНК-лигазы – это ферменты, которые восстанавливают ковалентные фосфодиэфирные связи и таким образом концы однотяжевой линейной молекулы ДНК соединяются с кольцевой молекулой ДНК- плазмидой. Плазмида – это вектор. Так лиганды сшивают, склеивают молекулы ДНК. На этом этапе плазмида называется вектором или транскриптом.

4. Включение вектора в клетку-реципиент (Е.coli)

Условием включения вектора в клетку реципиента является то, что цитоплазматическая мембрана ее должна близко подходить к клеточной стенке, когда вектор входит внутрь клетки через окошечки.

5. Отбор гибридных клонов

 

 

 

Рис. 6. Получение гибридных клонов

 

Посев идет на питательную среду, содержащую, как пример, бензилпенициллин, при этом вырастают клоны клетки Е.coli с маркером в гибридной плазмиде.

У эукариот при образовании молекулы м РНК имеет место процесс сплайсинга (от английского splicing- созревание, сращивание). Ген у эукариот представляется не непрерывный, а мозаичной структуры, содержащей наряду с кодирующими, несущими информацию (так называемые экзоны), также некодирующие, не несущие информацию (интроны) последовательности. Фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза катализирует транскрипцию как экзонов, так и интронов. В процессе сплайсинга интроны с помощью ферментов вырезаются, а экзоны после удаления интронов сращиваются. При этом образуется функционирующая м РНК.

У прокариот процесс образования м РНК идет проще. При помощи РНК- полимеразы идет транскрипция соответствующего гена. Процесс сплайсинга у прокариот отсутствует. Образующаяся в процессе транскрипции молекула мРНК уже способна к функционированию.

 

Рис.7. Матричный синтез у прокариот и эукариот

 

⇐ Предыдущая78910111213141516Следующая ⇒

Поделиться: