Аминокислота - целевой продукт

 

 

Если ферменты биосинтеза аминокислоты накапливаются внутриклеточно, то после 1-й ступени клетки сепарируют, дезинтегрируют и применяют клеточный сок. В других случаях для целей биосинтеза целевых продуктов применяют непосредственно клетки.

Имея задачу получения аминокислот, используя природные микроорганизмы, надо помнить о механизмах регуляции биосинтеза по принципу обратной связи (ретроингибирование). Эта регуляция осуществляется либо за счет ингибирования активности одного из начальных ферментов собственного синтеза избыточным продуктом, то есть самой аминокислотой, либо репрессируется весь комплекс ферментов всей биохимической цепочки метаболизма клетки, что является естественной реакцией живого микроорганизма-продуцента для сохранения собственного равновесия на клеточном уровне. Таким образом, перед биотехнологом стоит задача в нарушении этих механизмов, чтобы иметь возможность получить целевой продукт в необходимых количествах.

Как это делается, можно рассмотреть на примере продуцентов лизина (Corynebacterium glutaminicum) и треонина (Escherichia coli).

У Corynebacterium glutaminicum есть принцип согласованного ингибирования ферментативной активности, что является особенностью биосинтеза биосинтеза предшественника лизина. Ингибирование синтеза лизина в клетке возможно только при повышенной концентрации обеих конечных продуктов – лизина и треонина. Самостоятельно ни лизин, ни треонин не ингибируют активности ключевого фермента –аспартакиназы. Они ингибируют этот синтез только вместе. Таким образом, вызвать сверхсинтез лизина можно лишь нарушив синтез треонина или его предшественника – гомосерина. Действительно, большинство продуцентов лизина не способны синтезировать гомосерин или треонин, то есть являются «ауксотрофами» по этим аминокислотам. Таким образом большинство продуцентов лизина нуждается в присутствии гомосерина или треонина, иначе они работать не будут. Зная это, биотехнолог, выращивая такие продуценты, должен обязательно вносить в питательную среду от половины грамма и до полутора граммов на один литр гомосерина или треонина. В этом случае происходит активный рост биомассы продуцента без синтеза лизина. Как только треонин исчезает из среды и рост биомассы прекращается, начинается активный синтез лизина. Таким образом, данный процесс имеет две стадии развития:

1. рост биомассы

2. синтез лизина

Продолжительность синтеза составляет 2-3 суток. Уровень накопления продукта составляет 50-100 граммов на литр. Это особенности биосинтеза лизина.

Второй пример. Синтез треонина. Особенности регуляции биосинтеза треонина в клетках Escherichia coli (кишечной палочки). В этом случае ситуация другая. У кишечной палочки нет механизма согласованного ингибирования ферментативной активности, то есть, если лизин ингибирует активность своих ферментов по принципу обратной связи, то треонин – своих ферментов. Кроме того, имеет место «репрессия» всего комплекса треониновых ферментов при избытке треонина или изолейцина и это похоже на «согласованную репрессию» Самостоятельно (по отдельности) ни треонин, ни изолейцин не репрессируют синтез ферментов.

Для решения задачи получения треонина в необходимых количествах пришлось сделать следующее:

1. изменить, сделать нечувствительным к треонину первый фермент треонина

2. снизить активность фермента, синтезирующего из треонина изолейцин

3. убрать механизм репрессии при недостаточном количестве изолейцина несмотря на избыток треонина

4. применить генную инженерию (выделить треониновые гены и размножить их на плазмидах в клетке микроорганизма, резко повысив синтез треонина клетками продуцента)

В рассматриваемом случае синтез треонина отличается от синтеза лизина тем, что его синтез происходит одновременно с ростом биомассы. Здесь уже нет двух стадий.

Особенности культивирования штаммов-продуцентов аминокислот приводят к следующему результату:

1. достигаются максимально высокие скорости синтеза аминокислот клетками продуцента

2. достигается максимальная длительность работы продуцента

3. минимально образуются побочные продукты биосинтеза аминокислот.

Первая задача решается путем выращивания высокоактивной биомассы и помогают в этом случае наличие в питательной среде: источников углерода, аммонийного азота, минеральных солей, ростовых факторов; оптимизация рН (кислотность среды) температуры; дробная подача субстратов.

Для предотвращения закисления среды проводят автоматическое рН- статирование аммиачной водой и источниками углерода.

В случае биосинтеза лизина добавляют ростовые факторы по мере необходимости, что зависит от самого сырья, от аппаратуры, от температуры.

Процесс биосинтеза энергоемкий и требует интенсивной аэрации и перемешивания.

Для длительной работы ауксотрофных продуцентов лизина в питательную среду вносят комплексный источник аминокислот (белковые гидролизаты).

Внимание! Синтез нужной аминокислоты может прекращаться, если на ее продуцент действуют его токсические метаболиты, которые синтезируются самим продуцентом. Например, в процессе биосинтеза фенилаланина, продуцентом которого является Bacillus subtilis, этот продуцент синтезирует примеси ацетоина и бутандиола, в результате этого клетки продуцента лизируются, образуют споры и прекращают вырабатывать фенилаланин. Чтобы избежать это явление, необходимо ферментацию вести в условиях лимита (ограничения) по источнику углерода. В этом случае весь сахар расходуется только на синтез фенилаланина, увеличивая как количество (в два раза), так и чистоту получаемого продукта.

Хочется отметить, что:

- эффективность использования субстрата при биосинтезе аминокислот зависит от продуктивности биомассы,

- если синтез аминокислот разобщен с ростом биомассы (смотри лизин), то эффективность использования субстрата будет тем выше, чем дольше будет работать культура после остановки роста,

- если же синтез аминокислоты идет параллельно росту биомассы (смотри треонин), то эффективность биомассы можно увеличить добавляя определенное количество предшественников.

Наиболее перспективным направлением являются методы генетической инженерии – введение в клетку продуцента многокопийных плазмид, содержащих гены, контролирующие биосинтез аминокислот в ущерб синтезу биомассы и других клеточных компонентов.

В заключение можно сказать:

1. Применение генной инженерии при синтезе витамина В₂ и витамина С – открыло новые возможности селекции высокоактивных продуцентов.

2. Внедрение непрерывного способа ферментации в производстве сорбозы увеличило скорости образования этого сахара почти в два раза.

3. Дробная подача компонентов в питательные среды обеспечило высокий уровень ферментации в производстве витамина В₁₂ и сорбозы.

4. Применение иммобилизованных клеток при получении витаминов В₁₂ и В₃ привело к разработке новых конструкций биореакторов.

5. Утилизация различных промышленных отходов существенно снижает себестоимость получаемой продукции – витаминов В₂, В₁₂ и β -каротина, улучшает экологию производства.

6. С помощью гибридных плазмид в биосинтезе аминокислот мы получаем:

Ø рост продуктивности биомассы

Ø исчезновение примесей (более чистый продукт)

Ø возрастает коэффициент использования субстрата (его минимум дает максимум продукта).

Таким образом, получение этих важных биологически активных веществ (БАВ) свидетельствует о существенном вкладе биотехнологии и в этом секторе фармацевтической промышленности.

 

Список использованной литературы:

1. Биотехнология. Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева – М.: «Академия», 2007 г. – 215 с.

2. Егорова Т. А. Основы биотехнологии: Учеб. пособие для высш. пед. учеб заведений / Т.А.Егорова, С.М.Клунова, Е.А.Живухина. — М.: Издательский центр «Академия», 2003. — 208 с.

3. Катлинский А.В., Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И., Курс лекций по биотехнологии / ММА им. И.М. Сеченова, 2005 г. – 150 с.

4. Османов В.К., Лекции по биотехнологии/Ниж ГМА, 2008 г. – 250 с.

5. Основы фармацевтической биотехнологии, Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева, Л.С. Белова – Ростов н/Д.: Феникс, 2006 г. – 180 с.

6. Тимощенко Л.В., Чубик М. В. Основы микробиологии и биотехнологии: учебное пособие /Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик. – Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2009. – 194 с.

7. Фармацевтическая биотехнология: учеб. пособие / В.А. Быков (и другие) под общ. редакцией акад. РАМН и РАСНХ, профессора В.А. Быкова – Воронеж: издательство Воронеж. гос. ун-та, 2009. – 439 с.

Интернет ресурсы:

8. www.biotechnolog.ru

9. Биотехнология: генная инженерия, промышленная биотехнология, клеточная инженерия – учебное пособие: [электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www. biotechnolog.ru

10. Биоинформатика, геномика, протеомика. биософт, имейджинг: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.bioinFormatix.ru

11. Интернет журнал «Коммерческая биотехнология»: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.cbio.ru

12. Общество биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.biorosinfo.ru Remedium.ru:

13. Профессионально о медицине и фармации [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.remedium.ru

14. Новости GMP – Стандарт GMP – Фармацевтические производства и технологии [Электронный ресурс]. – Режим доступа http: //www.gmpnews.ru

15. Ассоциация Российских фармацевтических производителей [Электронный ресурс]. – Режим доступа http: //www.arfp.ru

Лекция №6

Тема лекции: Получение антибиотиков. Разработка новых биотехнологий и усовершенствование антибиотиков.

План лекции:

1. Понятие антибиотиков

2. Классификация антибиотиков

3. Промышленное получение антибиотиков

4. Методы культивирования продуцентов антибиотиков

5. Частная биотехнология антибиотиков

6. Ретроингибирование антибиотиков и преодоление этого процесса

7. Теория взаимозаменяемости антибиотиков

Оснащение лекции: презентация

Место проведения: аудитория 525

 

 

Вторичные метаболиты (идиолиты) – это низкомолекулярные соединения, не требующиеся на стадии роста чистой культуры, однако они необходимы для функционирования зрелой популяции. Часто они выполняют защитную роль при конкуренции с другими микроорганизмами. К ним относятся антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений, токсины.

 

Антибиотики являются «средством преодоления стрессовых ситуаций» для м/о. Антибиотики для почвенных м/о являются не только средствами борьбы, они также являются низкомолекулярными «эффекторами» м/о; с их помощью м/о меняет свой метаболизм при неблагоприятных условиях (например, спорообразование).

Гипотезы возникновения антибиотиков.

1. При происхождении жизни на земле антибиотики являлись стимуляторами или ингибиторами процесса матричного синтеза – они являлись «реликтовыми молекулами» у первичных форм жизни. Но привозникновении рибосом, появились другие регуляторы, они оказались вытесненными и сохранились только у некоторых м/о. У этих м/о из стимуляторов синтеза белка они превратились в ингибиторы.

2. Антибиотики – случайные продукты м/о. Плазмида – кольцевая ДНК – циркулирует по микробным популяциям. При передаче плазмиды другому м/о в результате рекомбинаций и мутаций могут синтезироваться «случайные вещества», из которых образовались антибиотики.

Понятие антибиотиков

Антибиотиками называют продукты жизнедеятельности организмов, обладающие антибактериальным действием. Большинство известных в настоящее время антибиотиков являются веществами, выделяемыми различного вида микроорганизмами – бактериями, дрожжами, плесенями, актиномицетами. Антибиотики получены также из животных тканей и высших растений (фитонциды).

Идея использования антагонизма между микроорганизмами (так называемого «антибиоза») для подавления болезнетворных микробов принадлежит И. И. Мечникову, положившему в конце прошлого века начало современному учению о лекарственных веществах микробов.

Для того чтобы антибиотическое вещество могло быть применено в медицинской практике, необходима совокупность высокой антибактериальной активности и отсутствия токсического действия по отношению к макроорганизму. Из большого числа выделенных и изученных антибиотиков этому важнейшему требованию удовлетворяют очень немногие соединения.

В химическом отношении антибиотики – вещества очень разнообразные, хотя некоторые из них представляют целые классы с подобной структурой, например: пенициллины, тетрациклины и др. В настоящее время установлено, что вещества, сходные по химической структуре, сходны и по характеру действия. Так, пенициллины действуют на клеточную стенку бактерий и препятствуют ее синтезу. Некоторое время бактерии еще размножаются, но, лишенные клеточной стенки, скоро погибают.

Антибиотик стрептомицин, проникнув в клетку микроба, достигает рибосом (места синтеза белков) и блокирует их деятельность.

Актиномицин действует на молекулу ДНК, в результате становится невозможным синтез информационной РНК, переносящей к рибосомам «приказы» ДНК о синтезе белков. Сходное действие проявляет и рифампицин, хотя и несколько иным способом: он снижает активность РНК-полимеразы и РНК не может образовываться.

На ДНК действуют и молекулы противоопухолевого антибиотика митомицина С: прочно связываясь с ней, он препятствует дальнейшему синтезу ДНК.

При повторных воздействиях молекул антибиотика клетка микроба погибает. Если же антибиотик вводится в недостаточном количестве, то клетки микроба восстанавливаются, и микроб выживает и дает потомство, устойчивое (резистентное) к действию данного антибиотика.

Приведенные примеры действия антибиотиков – это лишь отдельные случаи их разнообразного биохимического воздействия на микроорганизмы.

Классификация антибиотиков

Среди основных принципов классификации антибиотиков рассмотрим следующие:

1. Классификация антибиотиков по биологическому происхождению:

а) антибиотики, вырабатываемые микроорганизмами, относящимися к эубактериям;

б) антибиотики, образуемые микроорганизмами, принадлежащими к порядку Actinomycetales;

в) антибиотики, образуемые цианобактериями;

г) антибиотики, образуемые несовершенными грибами;

д) антибиотики, образуемые грибами, относящимися к классам базидимицетов и аскомицетов;

е) антибиотики, образуемые лишайниками, водорослями и низшими растениями;

ж) антибиотики, образуемые высшими растениями;

з) антибиотики животного происхождения.

2. Классификация по спектру биологического действия: По типу действия антибиотики делят на бактерицидные (лактамные, аминогликозиды), вызывающие гибель микроорганизмов, и бактериостатические (макролиды, тетрациклины, левомицетин), нарушающие способность микроорганизмов делиться.

По спектру действия различают антибиотики:

а) противобактериальные антибиотики узкого спектра действия, активные преимущественно в отношении грамположительных организмов;

б) противобактериальные антибиотики широкого спектра действия, относят тетрациклины, макролиды, аминогликозиды, которые особенно полезны в случае неидентифицированных воз­будителей болезни, однако при длительном применении они вы­зывают у пациентов дисбактериоз;

в) противотуберкулезные антибиотики;

г) противогрибные антибиотики;

д) противоопухолевые антибиотики

3. Классификация антибиотиков по химическому строению:

а) антибиотики ациклического строения;

б) антибиотики алициклического строения;

в) тетрациклины;

г) ароматические антибиотики;

д) антибиотики–хиноны;

е) антибиотики–кислородсодержащие гетероциклические соединения;

ж) антибиотики–азотсодержащие гетероциклические соединения;

з) антибиотики–аминогликозиды;

и) металлсодержащие антибиотики.

⇐ Предыдущая15161718192021222324Следующая ⇒

Поделиться: