Частная биотехнология антибиотиков

Производство пенициллинов

В 1871 г. В.А. Манасеиным было установлено, что зеленая плесень Penicillium glaucum при своем росте уничтожает бактерии, попадающие в культуральную среду. Это свойство Penicillium было тогда же использовано врачом А. Г. Полотебневым, применившим смоченные этой плесенью повязки при лечении гнойных ран и язв.

Выдающееся открытие русских ученых не получило широкой известности, и в 1928 г. англичанин Александр Флеминг вторично обнаружил 2жспособность плесневого грибка Penicillium угнетать рост микроорганизмов. Было показано, что вызываемая плесенью гибель микробов обусловлена образованием неизвестного органического вещества, на-званного пенициллином. Однако выделение пенициллина в чистом виде в то же время осуществлено не было, так как он оказался веществом очень лабильным, а применявшиеся методы очистки были несовершенны.

В годы Второй мировой войны огромная практическая потребность в эффективных антибактериальных препаратах привлекла к пенициллину внимание широкого круга специалистов, и примерно с 1939 г. начался период интенсивных исследований. Благодаря этому в относительно короткий срок (3–5 лет) англичанами Х. Флори и А. Чэттеном были разработаны способы промышленного получения и очистки пенициллина, изучены его лечебные свойства и методы клинического применения, а также установлена его химическая структура.

Для практических целей медицины пенициллин получают в промышленности путем биосинтеза. Процесс биосинтеза складывается из следующих стадий: 1) выращивания посевного материала (микроорганизмов) в аппаратах малой емкости – инокуляторах; 2) выращивания посевного материала в больших посевных аппаратах; 3) процесса ферментации; 4) выделения антибиотика из культуральной жидкости и его очистки.

Важное значение имеет также селекционный подбор высокопроизводительных штаммов плесени, подготовка и стерилизация питательной среды и аппаратуры.

Очень важное значение для высокого выхода пенициллина имеет питательная среда, примерный состав которой (в %) следующий:

Кукурузный настой – 3 (по объему)

Сульфат цинка – следы

Лактоза (или глюкоза) – 2 (по весу)

Карбонат кальция – 0, 25

Нитрат натрия – 0, 6

Магний сернокислый гептагидрат –0, 05

Калий фосфорнокислый (однозамещенный) – 0, 15

Вода ~ 90

Вместо какурузного настоя успешно применяется мука из хлопковых семян или мясные гидролизаты.

Приготовленную питательную среду подвергают стерилизации. Процесс ведут в колоннах непрерывного действия. Далее питательная среда поступает в аппарат-выдерживатель, где охлаждается в течение определенного времени до температуры 23–25 ^оС.

Первая стадия процесса – выращивание стандартной колонии штаммов плесени Penicillium chrysogenum – проводится в инокуляторах на питательной среде, где процесс идет ~30 часов. Подготовленный инокулят передают в посевной аппарат, объем которого ~ в 10 раз больше объема инокулятора. В посевном аппарате находится также стерилизованная питательная среда. Процесс роста здесь идет ~15–20 часов, и далее посевной материал передается на ферментацию в большие реакторы – ферментаторы объемом до 100 м3 на питательную среду. Процесс ферментации идет ~70 часов при температуре 23–24 ^оС, рН среды 6–6, 5 и постоянной аэрации воздуха – 1 л воздуха/1 литр питательной среды/1 мин по всему объему ферментатора.

Основная задача этого процесса – создание оптимальных условий для развития продуцента и накопления антибиотика. Биосинтез антибиотика – двухфазный процесс. В течение первой фазы происходит быстрый рост и размножение мицелия или бактериальных клеток. Культуральная жидкость в этот период богата углеводами, азотом и неорганическим фосфором. Продукты обмена веществ микроорганизмов, в том числе и антибиотики, находятся в малых количествах.

Вторая фаза начинается с момента замедления роста культуры. Протекает она в культуральной жидкости, обогащенной продуктом жизнедеятельности организма с небольшим количеством углеводов и фосфора. В начале этой фазы мицелий обладает максимальной способностью к синтезу антибиотика. Фазы отличаются характером и интенсивностью биохимических реакций. С учетом этих различий подбирают условия, благоприятные для первой и второй фаз развития продуцента.

Для увеличения выхода антибиотика в питательную среду вводят «предшественники», т. е. химические вещества, способствующие целенаправленному синтезу антибиотика. Так, в питательную среду при биосинтезе пенициллина вводят «предшественник» фенилацетамид – это увеличивает выход антибиотика более чем в 2 раза.

По окончании процесса ферментации культуральную массу передают на процесс выделения антибиотика.

Большинство продуцентов при биосинтезе выделяют антибиотик в водную фазу, поэтому процесс выделения антибиотика начинается с разделения твердой и жидкой фаз.

Твердая фаза, кроме массы мицелия, содержит значительное количество коллоидных примесей, затрудняющих фильтрование, поэтому культуральную массу предварительно подвергают различным типам коагуляции (электролитической, тепловой, кислотной и т. д.). Наиболее эффективным методом коагуляции культуральной массы является ее обработка флокулянтами (высокомолекулярными полиэлектролитами), например, поли-(4-винил)-N-бензилтриметиламмонийхлоридом. Оставшийся от фильтрации мицелия водный раствор антибиотика направляют на химическую очистку и выделение. Таким образом, водный раствор пенициллина направляют после фильтрации на экстракцию бутилацетатом при рН водной среды, равной 2. При таком значении кислотности среды подавляет кислотная ионизация пенициллина в водной фазе и он переходит в органическую фазу (в бутилацетат). Реэкстракцию пенициллина из бутилацетата проводят слабыми растворами щелочей.

Широко применяются сорбционные методы выделения и очистки антибиотиков. В качестве сорбентов широко используются синтетические ионообменные смолы.

Сушат пенициллины методом сублимации или распыления.

Угроза резистентности. Успехи применения бензилпенициллина в лечении болезней, вызванных различными бактериями, были поистине сенсационными. Чувствительными к нему оказались и стафилококки, являющиеся возбудителями очень серьезных заболеваний. Статистические данные показывают, что в 1944 г. число инфекционных больных, вылеченных бензилпенициллином, было около 99, 8 %, однако, уже в 1956 г. этот процент снизился до 65 %, особенно большой процент инфицированных больных, не поддававшихся лечению бензилпенициллином, наблюдался среди работников предприятий, производящих антибиотики, и работников хирургических клиник, широко использующих антибиотики для лечения больных.

Почему же именно эти заведения стали рассадниками болезнетворных организмов, устойчивых к действию пенициллина? Уже со времени первого применения пенициллина стало известно, что некоторые стафилококки невосприимчивы к нему. Чувствительные к пенициллину штаммы стафилококков погибают при лечении, остаются резистентные стафилококки, которые начинают размножаться и заполнять опустевшую нишу. И, таким образом, применение пенициллина для лечения заболеваний, вызванных резистентными формами стафилококка, не приведет к положительному результату.

Каким же путем избегают гибели стафилококки, резистентные к пенициллину? Было установлено, что они способны обезвредить молекулу пенициллина, изменив его структуру в самом слабом месте. Устойчивые стафилококки вырабатывают фермент, который может разрушить молекулу пенициллина при добавлении к ней молекулы воды. При этом процессе (гидролизе) образуется соединение, безвредное для микробов.

Фермент, способствующий реакции «обезвреживания», называется пенициллиназой. Его возникновение вызывается присутствием в среде пенициллина. С 1969 г. стала известна и химическая структура пенициллиназы, вырабатываемой стафилококками. В построении ее молекулы участвуют 257 структурных единиц двадцати аминокислот, соединенных в различной последовательности.

Другие бактерии образуют ферменты (ацилазы), которые разрывают связь между основным ядром молекулы бензилпеницилина и ее боковой ацильной группой, образуя биологически неактивную 6-аминопеницилановую кислоту

Второе расщепление ученые стали использовать для своих целей как возможность изменить молекулу пенициллина таким образом, чтобы ацилаза не смогла подвергнуть ее гидролизу. Таким способом были получены новые полусинтетические пенициллины.

⇐ Предыдущая18192021222324252627Следующая ⇒

Поделиться: