Влияние электромагнитного поля на живые организмы

РЕФЕРАТ

Доник Ю.Н.Исследование процессов свободорадикального окисления в жидкостях организма под воздействием ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО поля. Курсовая работа: 63 с., 7 рис., 1 табл., 30 источников.

ЭЛЕКТРОМАГНИТНОЕ ПОЛЕ, СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ, СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ, АНТИОКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА, ЭПР спектроскопия, ХЕЛЮМИНИСЦЕНЦИЯ

Объектом исследования дипломной работы являются свободные радикалы, возникающие в крови лабораторных животных под воздействием ЭМП

Целью данной работы являлось изучение литературы, посвященной процессам свободнорадикального окисления, изучению методов регистрации свободных радикалов в крови, а также разработка методики определения количества свободных радикалов в крови под воздействием ЭМП.

В результате выполнения курсовой работы проведен поиск и изучение необходимого материала по воздействию электромагнитного поля на живые организмы, проанализированы методы исследования свободнорадикального окисления и изучена литеретура, описывающая процессы, происходящие в окислительно-восстановительной системе организма.

Содержание

Обозначения и сокращения

ВВЕДЕНИЕ

Во все периоды своей эволюции биосфера изменялась под воздействием различных экологических факторов вырабатывая способность к саморегуляции и нейтрализации негативных процессов. Однако по мере развития человеческого общества планетарная экосистема, адаптированная к воздействию природных факторов начала испытывать действие антропогенных факторов, подавляющее большинство которых носит целенаправленный характер. Вносимые человеком существенные изменения в характер геофизических факторов, как правило, резко повышают интенсивность их воздействия. Одним из таких факторов является электромагнитное поле (ЭМП).

В связи с этим возникает необходимость исследования воздействия ЭМП (как низкочастотного, так и низкоинтенсивного) на растения, животных и человека. Даже незначительное варьирование параметров электромагнитного воздействия может привести к изменению не только интенсивности ответной реакции биологической системы, механизмов ее протекания, но и к смене реакции на противоположную.

Большой интерес представляет не только исследование взаимодействия ЭМП с биологическими системами в целом, но и с их отдельными элементами. К последним можно отнести клетки, липиды, белки, а также их водные растворы. В водной среде функционируют большинство биологически активных веществ. Взаимодействие воды с мономерами во многом определяет конфигурацию макромолекулы, а следовательно, и ее возможное поведение при воздействии ЭМП.

Свободные радикалы, содержащиеся в живых организмах, интересны тем, что они являются участниками важнейших физиологических процессов, процесса старения организма, а также различных патологических процессов при многих заболеваниях. Свободные радикалы могут возникать в организме в избыточном количестве вследствие радиоактивного и ультрафиолетового облучения, курения, избыточного потребления жиров и углеводов, а также под воздействием электромагнитного поля. Наша защита не справляется и стремительные цепные реакции окисления выходят из-под ее контроля.Поэтому важное научное значение имеет изучение процессов свободнорадикального окисления, отвечающих за важные функции живого организма.

Таким образом, целью данной работы являлось изучение литературы, посвященной процессам свободнорадикального окисления, изучению методов регистрации свободных радикалов в крови, а также разработка методики определения количества свободных радикалов в крови под воздействием ЭМП.

Для достижения этой цели поставленыследующие задачи:

1. Изучение литературы, посвященной влиянию ЭМП низких частот на живые системы

2. Изучение литературы, посвященной процессам свободно-радикального окисления в организме

3. Изучение методов регистрации свободных радикалов в биологических жидкостях.

Влияние электромагнитного поля на живые организмы

~~(может 1.1 отсюда начинаться должен, )~~ так – тоже можно.

Целенаправленное использование электромагнитной энергии в самых разнообразных областях человеческой деятельности привело к тому, что к существующему естественному геомагнитному фону — электрическому и магнитному полям Земли, атмосферному электричеству, радиоизлучению Солнца и Галактики добавилось электромагнитное поле искусственного происхождения. Его уровень значительно превышает уровень естественного электромагнитного фона. Энергоресурс мира удваивается каждые десять лет, а удельный вес переменных электромагнитного поля (ЭМП) в электроэнергетике за это время возрастает еще в три раза. Биологически значимыми являются техногенные радиочастотные электромагнитные поля, а также низкочастотные поля, создаваемые воздушными линиями и подстанциями. Широкое распространение ЭМИ и их стремительное проникновение во все сферы деятельности человека привели к участившимся исследованиям в данной области.

Постоянный радиационный фон — это поток ионизирующих частиц, и энергия каждой из частиц, будучи поглощена веществом клетки, достаточна, чтобы вызвать распад или возбуждение любой ее молекулы. За один час в клетках ткани человека в различных регионах земного шара происходит от 200 млн. до 6 млрд. подобных микрособытий. Таким образом, все живущие на Земле организмы ежесекундно непрерывно подвергаются высокоэнергетическому излучению земного и космического происхождения.

В настоящее время достоверно установлена высокая биологическая активность ЭМП, все живое действительно чрезвычайно чувствительно к искусственным ЭМП антропогенного происхождения. Некоторые виды живых существ и растений особенно чувствительны к определенным частотам. Так, рыбы плохо переносят частоту 50 Гц при достаточно высокой напряженности поля. Рост леса замедляется при воздействии СВЧ с модуляцией 12, 25, 50 и 100 Гц. Цветы реагируют на звуковые частоты. На более высоком уровне организации возникает разнообразие и дифференцируется чувствительность к ЭМП.

Широко известны реакции организма на сильные воздействия. Намного сложнее вести речь об эффекте слабых воздействий, за которыми стоят так называемые отдаленные последствия — генетические и канцерогенные эффекты. Не исключено, что через какое-то время будет установлено, что антропогенные ЭМП относятся к числу беспороговых раздражителей.

Обзор существующих представлений о биологической активности ЭМП позволяет выделить два основных подхода к этой проблеме. Первый — связан с представлением об энергетическом взаимодействии, второй — с анализом информационного взаимодействия ЭМП с элементами биологической системы.

Энергетическое взаимодействие ЭМП с организмом человека

Процессы свободнорадикального окисления

Хемилюминесценция

Энергично протекающие химические реакции сопровождаются, как правило, выделением энергии в форме тепла; существуют, однако такие реакции, которые сопровождаются излучением света.

Хемилюминесценцией (ХЛ) называется свечение, сопровождающее химические реакции. Она наблюдается в том случае, если в реакции происходит выделение большого количества энергии, например в реакции взаимодействия двух радикалов или в реакциях с участием перекисей. В последнее время все больший интерес привлекает собственное (" сверхслабое" ) свечение клеток и тканей животных и человека, которое обусловлено реакциями свободных радикалов: радикалов липидов и кислорода, а также окиси азота, - соединениями, играющими огромную роль в жизни организма, а при определенных условиях - и развитии ряда патологических состояний.

Процессы жизнедеятельности, как теперь стало известно, практически всегда сопровождаются очень слабым излучением, которое иногда называют сверхслабым свечением или собственным излучением клеток и тканей [1]. Некоторые организмы обладают, однако способностью излучать довольно яркий свет, видимый простым глазом; это явление известно с древних времен и получило название " биолюминесценция".

В биохимических системах, т. е. в гомогенатах тканей, суспензиях клеток или клеточных органелл, смесях ферментов и субстратов, собственная хемилюминесценция в большинстве случаев отличается крайне низкой интенсивностью, и требуется особо чувствительная аппаратура, чтобы его обнаружить и измерить. Некоторые вещества, которые в отечественной литературе принято называть активаторами ХЛ (в англоязычной литературе используется термин enhancer), обладают способностью усиливать хемилюминесценцию, иногда во много тысяч раз.

Ниже на рисунке 1 приведена классификация явлений хемилюминесценции в биологических системах.

Рисунок 1 – Классификация явлений хемилюминесценции в биологических системах.

Помимо этого, слабым свечением сопровождается образование свободных радикалов при действии ряда физических факторов на объект: при облучении ионизирующей радиации наблюдается радиохемилюминесценциярадиохемилюминесценция, после облучения ультрафиолетом или видимым светом –фотохемилюминесценции, при пропускании электрического тока – электролюминесценция, при воздействии ультразвука –сонолюминесценция, при воздействии сил трения – триболюминесценция..

Преимущество ХЛ

Непосредственный химический анализ радикалов невозможен, так как

в отличие от обычных молекул их нельзя ни выделить, ни очистить вследствие огромной реакционной способности. Обычно определяютустойчивые молекулярные продукты реакций, в которых участвовалирадикалы. В настоящем обзоре мы не будем рассматривать ни методыопределения этих маркеров, ни методы, основанные на ингибированиипроцессов перехватчиками радикалов, например, такими какфенольные антиоксиданты (для радикалов гидроксила, липидов идругих органических молекул) или антиоксидантные ферменты(супероксиддисмутазадля САР и каталаза для H₂O₂) [29]. Эти методызачастую весьма эффективны, но не позволяют определять концентрациюили природу радикалов непосредственно.

Метод хемилюминесценции (ХЛ) обладает тем преимуществом, что, во-первых, он обычно не связан с изменением хода процессов в растворах, клетках или даже целых тканях, где регистрируется свечение, а во-вторых, весьма чувствителен при обнаружении именно высокореакционных радикалов.

Дело в том, что методом ХЛ непосредственно определяется не концентрациярадикалов, а скорость реакции, в которой они образуются. В самом общем случае реакция, в которой образование радикалов приводит к ХЛ, может быть представлена схемой:

Интенсивность свечения пропорциональна скорости последней реакции

I_CL= K⋅ k_e[P*], (1)

Где K– коэффициент, который характеризует чувствительность прибора к излучению с данным квантовым выходом и спектром.

Из-за высокой скорости реакций превращения радикалов [R·], в системе мгновенно устанавливается стационарное состояние, при котором скорости всех последовательных реакций одинаковы. Отсюда ясно, что интенсивность ХЛ пропорциональна скорости образованиярадикалов v1

I_CL= K⋅ k_e[P*] = K⋅ v₁. (2)

При прочих равных условиях между скоростьюобразования радикалов и их стационарной концентрацией имеетсяпрямая зависимость, так как

I_CL= K⋅ v1 = K⋅ k₂[R·]. (3)

Таким образом, метод ХЛ отражает концентрацию радикалов всистеме, как и методы спектрофотометрии или ЭПР. Но в отличиеот ЭПР, показания хемилюминометра не зависят от того, какова реакционноспособностьрадикалов.

В нашей схеме эта величина определяется константой k₂ скоростиреакции исчезновения радикалов R·.

Стационарная концентрациярадикалов определяется уравнением:

K⋅ v1 =K⋅ k₂[R·], откуда [R·] = v₁/ k₂. (4)

Методом ЭПР (как и другими методами спектроскопии илифлуориметрии)определяется именно стационарная концентрациявещества, в нашем случае радикалов [R·]. При увеличении реактивностирадикалов, то есть с ростом k2 величина [R·] падает, а вместе с темуменьшается регистрируемый сигнал. Даже если активных радикаловобразуется много, их будет не видно из-за высоких значений k2. ИнтенсивностьХЛ, напротив, не зависит от реакционной способности радикалов, так как при увеличении реактивности радикалов одновременно ив той же мере снижается стационарная концентрация радикалов, ихпроизведение остается постоянным, а вместе с тем не происходит иизменения интенсивности ХЛ (уравнение 3). Иными словами, методХЛ регистрирует даже самые активные радикалы, концентрациякоторых в изучаемой системе может быть исчезающее мала, и вэтом – его уникальность и преимущество перед другими методамиобнаружениярадикалов в химических и биологических системах.Чем активнее радикал, тем труднее его непосредственно обнаружитьметодом ЭПР, но для ХЛ этого ограничения не существует.

Из истории открытия

В 1944 году Евгений Константинович Завойский открыл явление электронного парамагнитного резонанса, которое заключается в том, что парамагнитные частицы, помещенные в постоянное магнитное поле, поглощают микроволновое электромагнитное излучение определенной (резонансной) частоты. Открытие электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) нашло разнообразные применения в физике, химии и биологии.

Почему вскоре после открытия явления ЭПР им заинтересовались ученые, работавшие в области биофизики и биохимии? Еще в конце 20-х годов известный американский биохимик ЛеонорМихаэлис высказал предположение, что в ходе окислительно-восстановительных процессов, протекающих в живой клетке, в качестве промежуточных продуктов биохимических реакций должны возникать свободные радикалы - молекулы с неспаренными электронами. Как известно, ковалентные химические связи между атомами в молекулах образуются за счет спаривания электронов, имеющих противоположные ориентации спина. Поэтому у большинства молекул с четным числом электронов суммарный магнитный момент равен нулю, такие молекулы диамагнитны. Если в ходе химических превращений (например, вследствие окислительно-восстановительных реакций или разрыва химических связей) у молекулы оказывается нечетное число электронов, то такая молекула приобретает свойства парамагнетика. В сложных биологических системах, состоящих из огромного числа разных молекул, относительное содержание парамагнитных молекул невелико. Связано это, в частности, с тем, что большинство свободных радикалов обладают повышенной реакционной способностью. Свободные радикалы легко вступают в химические реакции с различными внутриклеточными соединениями, в результате чего их времена жизни оказываются, как правило, очень короткими. Поэтому традиционными магнитометрическими методами было практически невозможно следить за химическими превращениями парамагнитных молекул в сложных биологических системах. Положение изменилось с появлением метода ЭПР, позволившего избирательно детектировать и изучать электронное строение различных парамагнитных частиц.

Первые работы по исследованию биологических объектов методом ЭПР выполнены в середине 50-х годов. В 1954 году Барри Коммонер со своими сотрудниками (США) обнаружил сигналы ЭПР в биологических образцах. Это были лиофильно высушенные препараты печени и растений. В Европе первое исследование биологических объектов методом ЭПР было независимо выполнено в 1955 году Л.А. Блюменфельдом и его сотрудником А.И. Калмансоном. Эти пионерские исследования положили начало широкому применению метода ЭПР в биологии и медицине.

Развитию метода ЭПР в 50-х годах способствовало то обстоятельство, что в связи с практическими потребностями (в первую очередь для целей радиолокации) в то время интенсивно развивались области науки и техники, связанные с исследованием микроволнового электромагнитного излучения. Все основные элементы, необходимые для конструирования спектрометров ЭПР (генераторы электромагнитного излучения с длиной волны l -3-10 см, волноводы и др.), уже выпускались радиотехнической промышленностью, и поэтому их можно было легко приспособить для изготовления спектрометров ЭПР в лабораторных условиях. Однако первые спектрометры ЭПР имели невысокую чувствительность, поэтому в ранних работах изучали, как правило, лиофильно высушенные биологические образцы. Связано это было с тем, что вода, присутствующая в нативных биологических системах, интенсивно поглощает микроволновое излучение. Нерезонансное поглощение микроволнового излучения водой резко снижало чувствительность спектрометров ЭПР. Однако техника спектроскопии ЭПР непрерывно совершенствовалась, а вместе с этим расширялись возможности использования метода ЭПР в биологии. Современные спектрометры ЭПР позволяют изучать парамагнитные молекулы непосредственно в процессе функционирования нативных биологических систем на разных уровнях их структурно-функциональной организации, таких, как молекулы биополимеров, макромолекулярные комплексы и субклеточные структуры, клетки, отдельные органы животных и растений, а также целые организмы. Методом ЭПР можно изучать даже небольших животных (например, подопытных мышей), помещаемых в специально сконструированный резонатор спектрометра. В современных биофизических, биохимических и медико-биологических лабораториях высокочувствительные спектрометры ЭПР стали привычными инструментами научного исследования.

Применение ЭПР исследований

С помощью методов ЭПР было исследовано большое число модельных фермент - субстратных систем, где удавалось наблюдать появление свободно - радикальных продуктов реакций, что явилось убедительным подтверждением теории Михаэлиса о появлении свободных радикалов в ходе ферментативных реакций. Большое количество данных было получено с помощью этих ЭПР исследований, при анализе действия излучений как на биологически важные макромолекулы, так и на ткани животных, семена и др. биологические объекты. Что может быть несказанно полезно для сельского хозяйства и животноводства.

Метод ЭПР находит широкое применение и в исследовании структуры белков, нуклеиновых кислот, а также биомембран. Это находит свое применение в медицине и здравоохранении.

Метод ЭПР начал применяться в биологических исследования почти сразу после его открытия. Первоначально биологические эксперименты проводили с лиофильно высушенными или замороженными образцами, так как сильное падение чувствительности ЭПР-спектрометров из-за большого содержания жидкой воды не позволяло работать с водосодержащими образцами. По мере развития техники ЭПР ограничения на содержание воды в образцах постепенно смягчаются.

Сигналы ЭПР различных растительных и животных тканей были обнаружены в самых первых экспериментах. Парамагнитными центрами, ответственными за сигналы ЭПР тканей, являются свободные радикалы и целый ряд парамагнитных металлов. Содержание свободных радикалов в различных тканях изменяется в пределах на 1 г сухой массы. Сигналы ЭПР различных тканей представляют собой несколько асимметричные синглеты с g-фактором 2, 003 - 2, 005 и шириной 1-2 мТл.

Сигнал может быть обусловлен целым рядом свободно-радикальных продуктов, вклад могут вносить витамины, гормоны, флавины и т.д. Накоплен обширный экспериментальный материал о связи сигналов ЭПР тканей с метаболизмом и патологическими состояниями клеток и тканей.

Помимо сигналов свободных радикалов в тканях наблюдается целый ряд сигналов металлов (Fe, Cu, Mn, Ni, Co). Эти металлы входят в состав металлопротеинов, принимающих участие в целом ряде ферментативных процессов. Комплексы металлов обладают гораздо более широкими сигналами, чем сигналы свободных радикалов, за счет сильного спин-орбитального взаимодействия, что приводит к коротким временам спин-решеточной релаксации, анизотропии g-фактора и сверхтонкого взаимодействия, отличиям значения g-фактора от g-фактора свободных радикалов. Кроме того, в связи с малыми временами спин-решеточной релаксации, характеризующей скорость установления равновесных значений заселенностей уровней, сигналы многих металлокомплексов не удаётся наблюдать при обычных температурах. Для исследования этих металлокомплексов применяют охлаждение образцов до температур, близких к температуре жидкого гелия.

Для исследований свободнорадикальных интермедиатов ферментативных реакций используется метод матричной изоляции, основанный на том, что из реакционной смеси через определенные промежутки времени после начала реакции отбирают пробы, которые быстро замораживают. Сигнал ЭПР замороженных образцов в этом случае отражает состояние в исследуемой системе на момент взятия пробы.

Метод ЭПР широко применяют в исследованиях фотосинтеза для изучения механизма первичных стадий разделения зарядов в реакционных центрах и процессов переноса электрона по цепи электронного транспорта.

Помимо изучения механизмов реакций, протекающих с участием парамагнитных частиц, метод ЭПР широко используют и для исследования структурно-динамических свойств макромолекул и биомембран. Для этих целей разработан метод спиновых зондов и меток, заключающийся в том, что в исследуемую систему вводят стабильный радикал, который либо ковалентно связывается с макромолекулой (спиновая метка), либо удерживается в системе за счет физических взаимодействий (спиновый зонд). Спектр этого радикала чувствителен к свойствам среды, в которую он внедрен. Разработанные теоретические подходы позволяют связать параметры спектра ЭПР с физическими параметрами системы: характером и скоростями движения молекул, конформационными изменениями структуры макромолекул и т.д. В качестве спиновых зондов часто используют нитроксильные радикалы, содержащие группировку, на которой локализован неспаренный электрон.

С помощью спиновых меток изучают пространственное расположение отдельных групп в белках и нуклеиновых кислотах, конформационные переходы, связанные с функционированием ферментов, и целый ряд других проблем молекулярной динамики. Диапазон времен молекулярных движений, измеряемых с помощью спиновых меток и зондов в настоящее время расширен до, т.е. до характерных времён движения интегральных мембранных белков.

Метод ЭПР открыл возможности глубокого изучения свободных радикалов, возникающих в биологических объектах под действием ионизирующего излучения. При облучении некоторых аминокислот образуются свободные радикалы, дающие весьма характерные спектры ЭПР со сложной СТС, за счет взаимодействия неспаренного электрона с протонами и с ядрами. Такие спектры характерны для глицина, аланина, валина, лизина, 14Nлейцина и др. аминокислот (14 аминокислот). Радиационный выход свободных радикалов для многих аминокислот по данным разных авторов составляет от 1 до 10 радикалов на 100 эВ поглощенной энергии.

Каким образом можно следить за превращениями химических соединений внутри клетки, содержащей огромное количество самых разных молекул? Еще задолго до широкого внедрения в практику биологических исследований метода ЭПР основным способом наблюдения за химическими превращениями молекул в клетке было измерение их оптических спектров. Спектры поглощения света разными молекулами, как правило, различаются. Кроме этого, оптические спектры молекул изменяются в результате химических превращений. Это дает возможность следить за функционированием некоторых биомолекул по их спектрам поглощения. Например, молекула гемоглобина меняет цвет при связывании кислорода (хорошо известно, насколько заметно отличаются по цвету венозная и артериальная кровь, которые по-разному насыщены кислородом). Однако далеко не за всеми внутриклеточными соединениями удается наблюдать оптическими методами. Так, например, в энергопреобразующих органеллах клеток растений и животных (хлоропласты и митохондрии) большинство молекул - переносчиков электронов не имеет столь отчетливых спектров поглощения, по которым можно было бы выделить их на фоне других молекул, сильно поглощающих свет.

С открытием ЭПР появились принципиально новые возможности в изучении сложных биоэнергетических систем. Метод ЭПР сыграл особую роль в исследовании структурно-функциональной организации цепей электронного транспорта энергопреобразующих органелл клетки. Известно, что запасание энергии в форме химической энергии макроэргических соединений связано с окислительно-восстановительными реакциями, среди которых особую роль играют процессы переноса электронов по цепям электронного транспорта (ЦЭТ) хлоропластов и митохондрий. Молекулы электронных переносчиков, входящих в состав ЦЭТ, в ходе окислительно-восстановительных превращений меняют магнитное состояние. Принимая или отдавая электрон, диамагнитная молекула переходит в парамагнитное состояние. При этом оказывается, что большинство электронных переносчиков, находясь в парамагнитном состоянии, дают хорошо различимые сигналы ЭПР. Методом ЭПР были обнаружены несколько новых компонент в ЦЭТ хлоропластов и митохондрий, выяснена их роль в процессах преобразования энергии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ДОПИСАТЬ

Свободные радикалы – важные участники регуляторных процессов в живых клетках, но одновременно – причина повреждения клеточных структур и триггер, запускающий каскад реакций самоуничтожения Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция клеток – апоптоза. Их ведущая роль в развитии практически всех болезней пожилого возраста и старении организма общепризнанна и является объектом многочисленных исследований. Однако средняя по времени (стационарная) концентрация этих активных частиц в живой клетке очень мала, и их прямое обнаружение обычными биохимическими методами практически невозможно. Метод хемилюминесценции основан не на анализе веществ, а на измерении скорости

реакций, сопровождающихся свечением, а именно такие реакции характерны для свободных радикалов. Метод ХЛ стал одним из основных методов изучения свободнорадикальных процессов в научных и клинических исследованиях. Нет сомнения, что он будет широко использоваться и в дальнейшем. Спектроскопия ЭПР также является очень полезным методом в определении конценрации свободных радикалов, однако этот метод, хоть и является высокоточным, очень труден. Т.к. для его реализации необходима длительная предварительная пробоподготовка. Однако, не смотря на подобные трудности – мы разработали методику определения количества семихинонных радикалов в лиофилизированной крови лабораторных животных.