Изучение процессов свободнорадикального окисления с помощью электронного парамагнитного резонанса и ядерного магнитного резонанса

 

Прямым методом анализа радикалов является метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Электронный парамагнитный резонанс (электронный спиновый резонанс), явление резонансного поглощения электромагнитного излучения парамагнитными частицами, помещенными в постоянное магнитное поле; один из методов радиоспектроскопии (рисунок 6). Используется для изучения систем с ненулевым электронным спиновым магнитным моментом (то есть обладающих одним или несколькими неспаренными электронами): атомов, свободных радикалов в газовой, жидкой и твердой фазах, точечных дефектов в твердых телах, систем в триплетном состоянии, ионов переходных металлов [108].

 

 

Рисунок 6. – Блок-схема ЭПР-спектрометра

В принципе он позволяет не только обнаруживать, но и идентифицировать многие радикалы путем анализа сверхтонкой структуры сигналов электронного парамагнитного резонанса. Однако в биологических системах он часто оказывается недостаточно чувствительным из-за крайне низкой стационарной концентрации радикалов в клетках и тканях. Например, обнаружить непосредственно методом электронного парамагнитного резонанса радикалы, образующиеся при взаимодействии ионов Fe²⁺ с гидропероксидами липидов, удалось только в проточной системе с большим расходом реактивов [112] или с использованием спиновых ловушек [109]. Последние могут, однако, влиять на протекающие в системе биохимические реакции или разрушаться в ходе некоторых из них.

Методом электронного парамагнитного резонанса можно определять концентрацию и идентифицировать парамагнитные частицы в любом агрегатном состоянии, что незаменимо для исследования кинетики и механизма процессов, происходящих с их участием. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса применяется в радиационной химии, фотохимии, катализе, в изучении процессов окисления и горения, строения и реакционной способности органических свободных радикалов и ион-радикалов, полимерных систем с сопряженными связями. Динамические эффекты в спектрах электронного парамагнитного резонанса обусловленном модуляцией величины констант сверхтонкого взаимодействия за счет внутри- и межмолекулярных химических реакций, позволяют количественно исследовать эти реакции.

Применение метода электронного парамагнитного резонанса в биологических исследованиях связано с изучением двух основных видов парамагнитных центров: свободных радикалов и ионов металлов переменной валентности. Изучение свободных радикалов в биологических системах связано с трудностью, заключающейся в низкой концентрации свободных радикалов, образующихся при жизнедеятельности клеток. Концентрация радикалов в нормально метаболизирующих клетках составляет по разным источникам примерно 10^-8 – 10^{-10 М}, в то время как современные радиоспектрометры позволяют измерять концентрации радикалов 10^-6 – 10 М. Повысить концентрацию свободных радикалов можно затормозив их гибель и повысив скорость их образования. Это можно сделать путем облучения(ультрафиолетового или ионизирующей радиацией) биологических объектов, находящихся при низкой температуре. Изучение структуры радикалов более или менее сложных биологически важных молекул и было одним из первых направлений применения метода электронного парамагнитного резонанса в биологических исследованиях.

Другим важным направлением применения метода электронного парамагнитного резонанса в биологических исследованиях было изучение металлов переменной валентности и/или их комплексов, существующих invivo.

Метод электронного парамагнитного резонанса начинает применяться и при исследовании радикалов в жидкофазных реакциях. Правда, по отмеченным ранее причинам, область применяемости его ограничивается в большинстве случаев сравнительно малоактивными радикалами и ионами-радикалами. При этом довольно часто, как известно, радикалы можно рассматривать практически как совершенно устойчивые продукты и изучать их химическими методами или простым магнитным взвешиванием.

В этих случаях электронный парамагнитный резонанс играет, тем не менее, незаменимую роль, поскольку он позволяет точно установить истинную структуру радикала (или иона-радикала). Так, применение метода электронного парамагнитного резонанса позволило точно установить строение ион-радикалов различных семихинонов, ароматических положительных и отрицательных ионов-радикалов и многих других малоактивных парамагнитных частиц.

Метод определения по спектрам электронного парамагнитного резонанса короткоживущих радикалов после их присоединения к подходящим акцепторам – спиновым ловушкам. Последние специально добавляют в реакционную смесь, где они реагируют с радикалами R•, образующимися в ходе изучаемых гомолитических процессов. Продукт их взаимодействия – спин‑ аддукты – достаточно стабильные радикалы, которые можно исследовать методом электронного парамагнитного резонанса в широком температурном интервале. Большой выбор спиновых ловушек с известными значениями констант скоростей присоединения к ним различных радикалов с неспаренными электронами на атомах углерода, кислорода, металла или другого элемента позволяет целенаправленно применять спектроскопию электронного парамагнитного резонанса для детектирования промежуточных парамагнитных частиц в гомолитических процессах и получать количественные данные об элементарных стадиях этих процессов в различных фазах. Поскольку спин‑ аддукты ряда радикалов весьма стабильны, их можно накапливать в ходе свободнорадикальных реакций, в том числе таких, которые протекают в живых организмах.

В последние годы метод электронного парамагнитного резонанса широко применяется к решению ряда медико-биологических задач. Он довольно успешно используется в следующих исследованиях: изучение состояния метаболических реакций и их молекулярного механизма, изучение молекулярных механизмов патологических изменений и установление возможности диагностики заболеваний методом электронного парамагнитного резонанса. Так, за прошедшие годы было установлено, что состояние эндогенных парамагнитных центров (ПМЦ) зависит от физиологического состояния организма, изменяется при лучевой болезни, злокачественном росте опухолей. В ряде работ получены данные, по-видимому, имеющие значение для диагностики некоторых заболеваний.

Применяется метод электронного парамагнитного резонанса для изучения плазмы, эритроцитов, слюны, секрета носа, желудочного, дуоденального и перитонеального содержимого, желчи, кала, синовиальной жидкости, содержимого кист верхнечелюстной пазухи, выделенных из организма здорового человека, а также больных ишемической болезнью сердца, железодефицитной анемией, язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, ревматоидным артритом и деформирующим остеоартрозом, поражением верхних дыхательных путей, больных перитонитом. Интерпретированы спектры электронного парамагнитного резонанса исследованных биологических жидкостей. Выяснены структуры, ответственные за ПМЦ. Изучены процессы формирования и роль гемового и негемового железа, меди, марганца, метгемоглобина, гем-NO, моно- и динитрозильных комплексов и свободных радикалов в развитии указанных заболеваний. Многолетний опыт применения метода электронного парамагнитного резонанса в медицине показывает, что он может с успехом применяться для решения ряда вопросов. Данный способ позволяет уточнить патогенез некоторых заболеваний внутренних органов терапевтического и хирургического профиля. Также им можно дифференцировать заболевания, изучать метаболизм и механизм действия лекарственных препаратов.

Медико-биологическое применение метода электронного парамагнитного резонанса состоит в исследовании свободных радикалов, что позволяет при изучении спектров облученных белков объяснить механизм образования свободных радикалов, проследить изменение первичных и вторичных продуктов при радиационном поражении. Электронный парамагнитный резонанс также используется для изучения фотохимических процессов, в частности фотосинтеза, для изучения концентрации свободных радикалов в воздухе.

 

⇐ Предыдущая12345678Следующая ⇒

Поделиться: