Собственное свечение клеток и тканей животных

Отечественный ученый А. Г. Гурвич был первым, кто указал на существование собственного слабого свечения клеток животных и растений, названного им " митогенетическими лучами". Согласно А. Г. Гурвичу, митогенетические лучи – это очень слабое ультрафиолетовое излучение клеток, которое индуцирует деление окружающих клеток. Хотя сам А. Г. Гурвич использовал для обнаружения лучей только " биологический детектор", то есть разные делящиеся клетки, его последователи в России (С. Родионов и Г. М. Франк, 1934г.) и за рубежом (R. Aubert, 1938) разработали физический детектор излучения: газоразрядный счетчик фотонов с кварцевым окном, прозрачным для УФ-лучей.

С помощью счетчика фотонов было изучено свечение в ходе ряда окислительно-восстановительных реакций, а также свечение биологических объектов, таких как суспензия дрожжевых клеток, проростки растений и даже нервно-мышечный препарат. Развития эта техника, однако, не получила из-за неустойчивой работы газоразрядных счетчиков и плохой воспроизводимости результатов.

В 1952 г. А. Стрелер создал высоко-чувствительный прибор для счета фотонов на основе фотоэлектронного фотоумножителя (ФЭУ), охлаждаемого жидким азотом, и применил его для изучения послесвечения зеленых листьев. В 1956 году группа итальянских авторов использовала сходную технику для изучения свечения проростков растений. Сверхслабое свечение животных клеток и тканей было изучено в работах автора данной статьи и Ф. Ф. Литвина (1959 г.) и Б. Н. Тарусова и сотрудников (1961 г.) также с помощью фотоумножителя, охлаждаемого жидким азотом. В настоящее время созданы высокочувствительные малошумящие ФЭУ, позволяющие без охлаждения регистрировать слабое собственное свечение клеток и тканей растений и животных.

В настоящее время слабое свечение удается изучать не только с растворах или суспензиях клеток, но и на целых органах в составе организма. На рисунке 4 изображен аппаратурный комплекс, применяемый для измерения собственного свечения тканей животного, например, печени или легкого.

 

Рисунок 4 –Измерение собственного свечения органов лабораторного животного (в данном случае –крысы).

 

Наиболее важные части комплекса –это совершенно непроницаемый для света ящик, в который помещают лабораторное животное, например крысу, и высокочувствительный приемник света –фотоумножитель, соединенный через усилитель и другие промежуточные устройства с самопишущим потенциометром или же персональным компьютером. Аналогичную конструкцию используют для изучения свечения изолированных органов, например, перфузируемого легкого или сердца. Добавляя в перфузионную жидкость ингибиторы или активаторы определенных реакций, можно судить о природе химических реакций, сопровождающихся свечением.

Таким способом было показано, что собственное свечение тканей могут быть ответственны три типа реакций:

1. Реакции так называемых активных форм кислорода.

2. Реакции цепного (перекисного) окисления липидов.

3. Реакции с участием окиси азота.

 

Преимущество ХЛ

 

Непосредственный химический анализ радикалов невозможен, так как

в отличие от обычных молекул их нельзя ни выделить, ни очистить вследствие огромной реакционной способности. Обычно определяютустойчивые молекулярные продукты реакций, в которых участвовалирадикалы. В настоящем обзоре мы не будем рассматривать ни методыопределения этих маркеров, ни методы, основанные на ингибированиипроцессов перехватчиками радикалов, например, такими какфенольные антиоксиданты (для радикалов гидроксила, липидов идругих органических молекул) или антиоксидантные ферменты(супероксиддисмутазадля САР и каталаза для H₂O₂) [29]. Эти методызачастую весьма эффективны, но не позволяют определять концентрациюили природу радикалов непосредственно.

Метод хемилюминесценции (ХЛ) обладает тем преимуществом, что, во-первых, он обычно не связан с изменением хода процессов в растворах, клетках или даже целых тканях, где регистрируется свечение, а во-вторых, весьма чувствителен при обнаружении именно высокореакционных радикалов.

Дело в том, что методом ХЛ непосредственно определяется не концентрациярадикалов, а скорость реакции, в которой они образуются. В самом общем случае реакция, в которой образование радикалов приводит к ХЛ, может быть представлена схемой:

 

 

Интенсивность свечения пропорциональна скорости последней реакции

 

I_CL= K⋅ k_e[P*], (1)

Где K– коэффициент, который характеризует чувствительность прибора к излучению с данным квантовым выходом и спектром.

Из-за высокой скорости реакций превращения радикалов [R·], в системе мгновенно устанавливается стационарное состояние, при котором скорости всех последовательных реакций одинаковы. Отсюда ясно, что интенсивность ХЛ пропорциональна скорости образованиярадикалов v1

 

I_CL= K⋅ k_e[P*] = K⋅ v₁. (2)

 

При прочих равных условиях между скоростьюобразования радикалов и их стационарной концентрацией имеетсяпрямая зависимость, так как

 

I_CL= K⋅ v1 = K⋅ k₂[R·]. (3)

 

Таким образом, метод ХЛ отражает концентрацию радикалов всистеме, как и методы спектрофотометрии или ЭПР. Но в отличиеот ЭПР, показания хемилюминометра не зависят от того, какова реакционноспособностьрадикалов.

В нашей схеме эта величина определяется константой k₂ скоростиреакции исчезновения радикалов R·.

Стационарная концентрациярадикалов определяется уравнением:

 

K⋅ v1 =K⋅ k₂[R·], откуда [R·] = v₁ / k₂. (4)

 

Методом ЭПР (как и другими методами спектроскопии илифлуориметрии)определяется именно стационарная концентрациявещества, в нашем случае радикалов [R·]. При увеличении реактивностирадикалов, то есть с ростом k2 величина [R·] падает, а вместе с темуменьшается регистрируемый сигнал. Даже если активных радикаловобразуется много, их будет не видно из-за высоких значений k2. ИнтенсивностьХЛ, напротив, не зависит от реакционной способности радикалов, так как при увеличении реактивности радикалов одновременно ив той же мере снижается стационарная концентрация радикалов, ихпроизведение остается постоянным, а вместе с тем не происходит иизменения интенсивности ХЛ (уравнение 3). Иными словами, методХЛ регистрирует даже самые активные радикалы, концентрациякоторых в изучаемой системе может быть исчезающее мала, и вэтом – его уникальность и преимущество перед другими методамиобнаружениярадикалов в химических и биологических системах.Чем активнее радикал, тем труднее его непосредственно обнаружитьметодом ЭПР, но для ХЛ этого ограничения не существует.

⇐ Предыдущая12345678Следующая ⇒

Поделиться: