Приборы для измерения хемилюминесценции

 

Время, когда для измерения слабого свечения приходилось охлаждатьфотоумножитель жидким азотом [6–12] или твердой углекислотой[3–5], вероятно, ушло безвозвратно. Современные фотоумножители и методы компьютерной обработки сигналов позволяют проводить регистрацию даже собственного свечения клеток и тканей, не говоряуже об активированной ХЛ. Однако специализированных приборов, непосредственно приспособленных для регистрации кинетикислабой ХЛ, сопровождающей образование свободных радикалов, выпускаетсямало.

На рисунке 5 представлен портативныйхемилюминометр, обладающий достаточной чувствительностьюи снабженный современной программой обработки данных PowerGraph.

 

 

A – внешний вид прибора:

1 – корпус, 2 – электромотор для мешалки, 3 – мешалка, 4 – кювета, помещенная внутрь светоизолированного термостата, 5 – светоизолированная трубочка для добавки растворов по ходу измерения.Приемноеустройство расположено под кюветой.

Б – изображение экрана компьютера с записью кривой хемилюминесценции

Стрелками показаны моменты добавкилюминола (Л) и стимула ФМА (С).

Запись и обработка кривых осуществленас помощью программы PowerGraph.

 

Рисунок 5 –Портативный хемилюминометр Lum-5773

 

В патогенезе многих болезней и патологических процессов играетважную роль оксидативный стресс [153]. Метод ХЛ оказывается полезнымпри изучении таких патологий, поскольку дает возможностьизмерять уровень свободных радикалов (АФК, NO), оценивать параметрыантиоксидантной защиты и влияние антиоксидантов. Хемилюминесценциюуспешно применяют при изучении иммунных нарушений, нарушений метаболизма, дисфункции эндотелия, ишемии/реперфузиимиокарда и мозга, онкологических и воспалительныхзаболеваний, а также многих других болезней, патогенез которыхсвязан с оксидативным стрессом.

 

Электронный парамагнитный резонанс

 

Прямой метод анализа радикалов – метод электронного парамагнитного резонанса или ЭПР. Он позволяет не только обнаруживать, но и идентифицировать многие радикалы путем анализа сверхтонкой структуры сигналов ЭПР. Однако в биологических системах он часто оказывается недостаточно чувствительным из‑ за крайне низкой стационарной концентрации радикалов в клетках и тканях. Например, обнаружить непосредственно методом ЭПР радикалы, образующиеся при взаимодействии ионов Fe²⁺ с гидропероксидами липидов, удалось только в проточной системе с большим расходом реактивов [30] или с использованием спиновых ловушек [31]. Последние могут, однако, влиять на протекающие в системе биохимические реакции или разрушаться в ходе некоторых из них.

 

Из истории открытия

В 1944 году Евгений Константинович Завойский открыл явление электронного парамагнитного резонанса, которое заключается в том, что парамагнитные частицы, помещенные в постоянное магнитное поле, поглощают микроволновое электромагнитное излучение определенной (резонансной) частоты. Открытие электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) нашло разнообразные применения в физике, химии и биологии.

Почему вскоре после открытия явления ЭПР им заинтересовались ученые, работавшие в области биофизики и биохимии? Еще в конце 20-х годов известный американский биохимик ЛеонорМихаэлис высказал предположение, что в ходе окислительно-восстановительных процессов, протекающих в живой клетке, в качестве промежуточных продуктов биохимических реакций должны возникать свободные радикалы - молекулы с неспаренными электронами. Как известно, ковалентные химические связи между атомами в молекулах образуются за счет спаривания электронов, имеющих противоположные ориентации спина. Поэтому у большинства молекул с четным числом электронов суммарный магнитный момент равен нулю, такие молекулы диамагнитны. Если в ходе химических превращений (например, вследствие окислительно-восстановительных реакций или разрыва химических связей) у молекулы оказывается нечетное число электронов, то такая молекула приобретает свойства парамагнетика. В сложных биологических системах, состоящих из огромного числа разных молекул, относительное содержание парамагнитных молекул невелико. Связано это, в частности, с тем, что большинство свободных радикалов обладают повышенной реакционной способностью. Свободные радикалы легко вступают в химические реакции с различными внутриклеточными соединениями, в результате чего их времена жизни оказываются, как правило, очень короткими. Поэтому традиционными магнитометрическими методами было практически невозможно следить за химическими превращениями парамагнитных молекул в сложных биологических системах. Положение изменилось с появлением метода ЭПР, позволившего избирательно детектировать и изучать электронное строение различных парамагнитных частиц.

Первые работы по исследованию биологических объектов методом ЭПР выполнены в середине 50-х годов. В 1954 году Барри Коммонер со своими сотрудниками (США) обнаружил сигналы ЭПР в биологических образцах. Это были лиофильно высушенные препараты печени и растений. В Европе первое исследование биологических объектов методом ЭПР было независимо выполнено в 1955 году Л.А. Блюменфельдом и его сотрудником А.И. Калмансоном. Эти пионерские исследования положили начало широкому применению метода ЭПР в биологии и медицине.

Развитию метода ЭПР в 50-х годах способствовало то обстоятельство, что в связи с практическими потребностями (в первую очередь для целей радиолокации) в то время интенсивно развивались области науки и техники, связанные с исследованием микроволнового электромагнитного излучения. Все основные элементы, необходимые для конструирования спектрометров ЭПР (генераторы электромагнитного излучения с длиной волны l -3-10 см, волноводы и др.), уже выпускались радиотехнической промышленностью, и поэтому их можно было легко приспособить для изготовления спектрометров ЭПР в лабораторных условиях. Однако первые спектрометры ЭПР имели невысокую чувствительность, поэтому в ранних работах изучали, как правило, лиофильно высушенные биологические образцы. Связано это было с тем, что вода, присутствующая в нативных биологических системах, интенсивно поглощает микроволновое излучение. Нерезонансное поглощение микроволнового излучения водой резко снижало чувствительность спектрометров ЭПР. Однако техника спектроскопии ЭПР непрерывно совершенствовалась, а вместе с этим расширялись возможности использования метода ЭПР в биологии. Современные спектрометры ЭПР позволяют изучать парамагнитные молекулы непосредственно в процессе функционирования нативных биологических систем на разных уровнях их структурно-функциональной организации, таких, как молекулы биополимеров, макромолекулярные комплексы и субклеточные структуры, клетки, отдельные органы животных и растений, а также целые организмы. Методом ЭПР можно изучать даже небольших животных (например, подопытных мышей), помещаемых в специально сконструированный резонатор спектрометра. В современных биофизических, биохимических и медико-биологических лабораториях высокочувствительные спектрометры ЭПР стали привычными инструментами научного исследования.

 

Применение ЭПР исследований

 

С помощью методов ЭПР было исследовано большое число модельных фермент - субстратных систем, где удавалось наблюдать появление свободно - радикальных продуктов реакций, что явилось убедительным подтверждением теории Михаэлиса о появлении свободных радикалов в ходе ферментативных реакций. Большое количество данных было получено с помощью этих ЭПР исследований, при анализе действия излучений как на биологически важные макромолекулы, так и на ткани животных, семена и др. биологические объекты. Что может быть несказанно полезно для сельского хозяйства и животноводства.

Метод ЭПР находит широкое применение и в исследовании структуры белков, нуклеиновых кислот, а также биомембран. Это находит свое применение в медицине и здравоохранении.

Метод ЭПР начал применяться в биологических исследования почти сразу после его открытия. Первоначально биологические эксперименты проводили с лиофильно высушенными или замороженными образцами, так как сильное падение чувствительности ЭПР-спектрометров из-за большого содержания жидкой воды не позволяло работать с водосодержащими образцами. По мере развития техники ЭПР ограничения на содержание воды в образцах постепенно смягчаются.

Сигналы ЭПР различных растительных и животных тканей были обнаружены в самых первых экспериментах. Парамагнитными центрами, ответственными за сигналы ЭПР тканей, являются свободные радикалы и целый ряд парамагнитных металлов. Содержание свободных радикалов в различных тканях изменяется в пределах на 1 г сухой массы. Сигналы ЭПР различных тканей представляют собой несколько асимметричные синглеты с g-фактором 2, 003 - 2, 005 и шириной 1-2 мТл.

Сигнал может быть обусловлен целым рядом свободно-радикальных продуктов, вклад могут вносить витамины, гормоны, флавины и т.д. Накоплен обширный экспериментальный материал о связи сигналов ЭПР тканей с метаболизмом и патологическими состояниями клеток и тканей.

Помимо сигналов свободных радикалов в тканях наблюдается целый ряд сигналов металлов (Fe, Cu, Mn, Ni, Co). Эти металлы входят в состав металлопротеинов, принимающих участие в целом ряде ферментативных процессов. Комплексы металлов обладают гораздо более широкими сигналами, чем сигналы свободных радикалов, за счет сильного спин-орбитального взаимодействия, что приводит к коротким временам спин-решеточной релаксации, анизотропии g-фактора и сверхтонкого взаимодействия, отличиям значения g-фактора от g-фактора свободных радикалов. Кроме того, в связи с малыми временами спин-решеточной релаксации, характеризующей скорость установления равновесных значений заселенностей уровней, сигналы многих металлокомплексов не удаётся наблюдать при обычных температурах. Для исследования этих металлокомплексов применяют охлаждение образцов до температур, близких к температуре жидкого гелия.

Для исследований свободнорадикальных интермедиатов ферментативных реакций используется метод матричной изоляции, основанный на том, что из реакционной смеси через определенные промежутки времени после начала реакции отбирают пробы, которые быстро замораживают. Сигнал ЭПР замороженных образцов в этом случае отражает состояние в исследуемой системе на момент взятия пробы.

Метод ЭПР широко применяют в исследованиях фотосинтеза для изучения механизма первичных стадий разделения зарядов в реакционных центрах и процессов переноса электрона по цепи электронного транспорта.

Помимо изучения механизмов реакций, протекающих с участием парамагнитных частиц, метод ЭПР широко используют и для исследования структурно-динамических свойств макромолекул и биомембран. Для этих целей разработан метод спиновых зондов и меток, заключающийся в том, что в исследуемую систему вводят стабильный радикал, который либо ковалентно связывается с макромолекулой (спиновая метка), либо удерживается в системе за счет физических взаимодействий (спиновый зонд). Спектр этого радикала чувствителен к свойствам среды, в которую он внедрен. Разработанные теоретические подходы позволяют связать параметры спектра ЭПР с физическими параметрами системы: характером и скоростями движения молекул, конформационными изменениями структуры макромолекул и т.д. В качестве спиновых зондов часто используют нитроксильные радикалы, содержащие группировку, на которой локализован неспаренный электрон.

С помощью спиновых меток изучают пространственное расположение отдельных групп в белках и нуклеиновых кислотах, конформационные переходы, связанные с функционированием ферментов, и целый ряд других проблем молекулярной динамики. Диапазон времен молекулярных движений, измеряемых с помощью спиновых меток и зондов в настоящее время расширен до, т.е. до характерных времён движения интегральных мембранных белков.

Метод ЭПР открыл возможности глубокого изучения свободных радикалов, возникающих в биологических объектах под действием ионизирующего излучения. При облучении некоторых аминокислот образуются свободные радикалы, дающие весьма характерные спектры ЭПР со сложной СТС, за счет взаимодействия неспаренного электрона с протонами и с ядрами. Такие спектры характерны для глицина, аланина, валина, лизина, 14Nлейцина и др. аминокислот (14 аминокислот). Радиационный выход свободных радикалов для многих аминокислот по данным разных авторов составляет от 1 до 10 радикалов на 100 эВ поглощенной энергии.

Каким образом можно следить за превращениями химических соединений внутри клетки, содержащей огромное количество самых разных молекул? Еще задолго до широкого внедрения в практику биологических исследований метода ЭПР основным способом наблюдения за химическими превращениями молекул в клетке было измерение их оптических спектров. Спектры поглощения света разными молекулами, как правило, различаются. Кроме этого, оптические спектры молекул изменяются в результате химических превращений. Это дает возможность следить за функционированием некоторых биомолекул по их спектрам поглощения. Например, молекула гемоглобина меняет цвет при связывании кислорода (хорошо известно, насколько заметно отличаются по цвету венозная и артериальная кровь, которые по-разному насыщены кислородом). Однако далеко не за всеми внутриклеточными соединениями удается наблюдать оптическими методами. Так, например, в энергопреобразующих органеллах клеток растений и животных (хлоропласты и митохондрии) большинство молекул - переносчиков электронов не имеет столь отчетливых спектров поглощения, по которым можно было бы выделить их на фоне других молекул, сильно поглощающих свет.

С открытием ЭПР появились принципиально новые возможности в изучении сложных биоэнергетических систем. Метод ЭПР сыграл особую роль в исследовании структурно-функциональной организации цепей электронного транспорта энергопреобразующих органелл клетки. Известно, что запасание энергии в форме химической энергии макроэргических соединений связано с окислительно-восстановительными реакциями, среди которых особую роль играют процессы переноса электронов по цепям электронного транспорта (ЦЭТ) хлоропластов и митохондрий. Молекулы электронных переносчиков, входящих в состав ЦЭТ, в ходе окислительно-восстановительных превращений меняют магнитное состояние. Принимая или отдавая электрон, диамагнитная молекула переходит в парамагнитное состояние. При этом оказывается, что большинство электронных переносчиков, находясь в парамагнитном состоянии, дают хорошо различимые сигналы ЭПР. Методом ЭПР были обнаружены несколько новых компонент в ЦЭТ хлоропластов и митохондрий, выяснена их роль в процессах преобразования энергии.

 

⇐ Предыдущая12345678Следующая ⇒

Поделиться: