Приготовление гистологического препарата

По характеру взятого материала различают следующие виды гистологических препаратов:

а) срезы органов (толщиной 5-15 нм),

б) мазки (крови, костного мозга и т.д.),

в) плёнки (брюшины, мягкой мозговой оболочки), или тотальные препараты

Чаще всего используются срезы.

Приготовление препарата обычно включает следующие этапы:

1. Взятие и фиксация материала. Из соответствующего органа вырезают небольшие кусочки (0, 5x1x1 см) и погружают их в фиксатор (формалин, метанол и т.д.) - обычно на 24 ч. Фиксация производится для предупреждения процессов аутолиза (самопереваривания) тканей. Это достигается путём денатурации (коагуляции) белков. После фиксации образцы промывают проточной водой в течение нескольких часов.

2. Обезвоживание и уплотнение материала. Затем образцы уплотняют - чтобы в последующем их можно было резать на микротоме.

Часто в качестве уплотнителя используют парафин. Предварительно образцы обезвоживают

Для этого их “проводят” по батарее спиртов -70 %, 80 %, 96 %, 100 % этанол - по 24 часа в каждом спирте.

3. Заливка: помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин на 1-2 ч при 52-56 о С. Дают парафину, остывая, затвердеть; вырезают из него блок с заключённым образцом и закрепляют на деревянном кубике. Микротомный нож, направляемый под углом к поверхности парафинового блока, срезает с него тонкой слой органа (срез) заданной толщины.

Срезы помещают на поверхность тёплой воды для их расправления, а затем - на предметное стекло.

4. Окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду. Перед окрашиванием образцы освобождают от парафина, проводя по батарее растворителей: ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода (по 2-5 мин).

Для окрашивания предметные стёкла со срезами помещают на короткое время в раствор красителя, промывают водой, обрабатывают раствором другого красителя (если таковой используется тоже) и вновь промывают водой.

Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом.

Таким образом, приготовление гистологического препарата - весьма долгая и трудоёмкая процедура. Но при правильном её выполнении полученный препарат может храниться неопределённо долгое время.

Методы окрашивания гистологических препаратов

Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на 4 типа: кислые, основные, нейтральные и индифферентные. Кислые красители – это кислоты и кислые соли (эозин и кислый фуксин) Окрашиваемые структуры называются оксифильными (имеющими сродство к кислым красителям).

Это белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры (коллагеновые волокна).

Основные красители - основные соли (гематоксилин, азур2 и кармин). Красящиеся структуры - это структуры, богатые нуклеиновыми или иными кислотами - ядра, рибосомы, аморфный компонент межклеточного вещества.

Нейтральные красители - смесь двух красителей: основного (азур2) и кислого (эозин). Структуры, воспринимающие кислые красители, окрасятся эозином; пример - специфические гранулы в эозинофильных лейкоцитах. Ядра всех клеток окрашиваются азуром 2.

Индифферентные красители. Судан III, судан IV. Суданом окрашиваются жировые капли (в которых он растворяется).

Общие методы окраски

1. Окраска гематоксилин – эозином - самый распространённый метод окраски. Сочетает основной и кислый красители. Поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры. Ядра приобретают сине-фиолетовый цвет, цитоплазма - желтовато-розовый цвет.

2 Окраска железным гематоксилином (по методу Генденгайна) Препарат предварительно обрабатывают (протравляют) железноаммиачными квасцами, а потом обрабатывают гематоксилином.Структуры приобретают коричневато-серый цвет. Хорошо выявляются структуры ядра, границы клеток, мышечные волокна.

Выявление неклеточных структур соединительной ткани

1. Окраска по методу ван Гизона. Краситель - смесь растворов пикриновой кислоты и кислого фуксина. Коллагеновые волокна (содержащиеся в межклеточном веществе соединительной ткани) окрашиваются в ярко-красный цвет, а элементы других тканей (напр., мышечные волокна) - в жёлтый цвет.

2. Окраска по методу Маллори. Краситель является трёхцветным: это смесь кислого фуксина, анилинового синего, оранжевого, а также двух кислот. Коллагеновые волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-синий цвет, многие другие структуры (ядра, мышечные волокна, эритроциты) - в оранжевый или красный цвет.

3. Импрегнация серебром. Препарат обрабатывают аммиачным раствором серебра, а затем - восстановителями. В итоге, выделяющееся серебро осаждается на определённых волокнах соединительной ткани. Ретикулярные (аргирофильные) волокна приобретают чёрный цвет, коллагеновые волокна - коричневый, ядра клеток - светло-коричневый.

4. Окраска орсеином. Эластические волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-красный цвет а, остальные структуры - в слабо-розовый цвет.

5. Окраска гематоксилин-пикрофуксином. Эластические волокна окрашиваются пикриновой кислотой в жёлтый цвет, коллагеновые волокна - в красный цвет, ядра клеток - окрашиваются гематоксилином в тёмно-фиолетовый цвет.

6. Окраска по методу Шморля. Используется для окраски костей и дентина. Предварительно кусочки материала подвергают декальцинации (с помощью кислоты), а затем выдерживают в растворе алюмокалиевых квасцов. Краситель - раствор тионина.

Стенки костных полостей и канальцев (выстланные сетью коллагеновых волокон) окрашиваются в тёмно-коричневый цвет; остальной фон - светло-коричневый.

 

Занятие № 2

Цитология: клетка, мембраны, органеллы, включения.

Клеточная теория. Основные положения теории

 

1. Клетка - наименьшая единица живого. Имеется в виду, что отдельные компоненты клетки (ядро, митохондрии и т.д.) не могут полноценно существовать в изолированном состоянии.

2. Клетки сходны по общему плану строения. Действительно, практически все клетки имеют 3 основных компонента: плазматическую мембрану, ядро и цитоплазму.

3. Клетки размножаются только путём деления (" каждая клетка - из клетки" ).

4. В организме клетки функционируют не изолированно, а в тесной связи друг с другом, образуя единое целое (ткани, органы, системы органов). Поэтому клетки весьма различны: одни настроены на выполнение одного круга функций, другие - другого.

 

Понятие о дифференцировке

Специализация каждого вида клеток достигается в процессе дифференцировки. В этот процесс вступают стволовые клетки, постепенно образуются структуры, необходимые для выполнения функций, теряются какие-то другие, ненужные уже структуры. В ряде случаев утрачивается и классическое клеточное строение.

Клеточные мембраны и структуры клеточной поверхности

Клетка в целом и многие внутриклеточные структуры (ядра, митохондрии, эндоплазматическая сеть и др.) окружены мембранами. Различают плазматическую мембрану, или (мембрана самой клетки), ядерную мембрану и т.д.

Принцип организации мембран

 

Схема - строение мембран.

1. В основе биологической мембраны - двойной слой липидов (1). Молекулы таких липидов (2) имеют 2 части - гидрофобную (2, а) (два углеводородных " хвоста" жирных кислот) и гидрофильную (2, б) (остатки спирта, азотистого основания, углевода).

В водной среде эти молекулы образуют бислой, в котором гидрофобные части молекул обращены друг к другу, а гидрофильные - к водной фазе.

В состав мембран входят белки: а) интегральные белки (3), насквозь пронизывают липидный бислой, б) периферические белки (4). Углеводные компоненты образованы гликолипидами и гликопротеидами.

Толщина плазмолеммы 7-10 нанометр-(нм)

Функции плазмолеммы

1. Опорная функция. Мембрана поддерживает форму клетки.

2. Рецепторная функция. Снаружи плазмолемма содержит специфические белки-рецепторы

3. Барьерная функция.

4. Транспортная функция.

Транспорт может осуществляться тремя способами:

1 Простая диффузия, облегчённая диффузия, активный транспорт. Перенос в клетку крупных частиц происходит путем пиноцитоза, фагоцитоза и эндоцитоза.

 

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: