Мікрометод визначення амінного азоту мідним способом

Принцип методу. Цей мікрометод визначення амінного азоту мідним способом був розроблений Войвудом і модифікований              Т.А. Глаголєвою. Принцип методу полягає в тому, що амінокислоти реагують із солями міді з утворенням розчинного мідного комплексу. Надлишок міді видаляють із розчину та визначають вміст міді в розчині або йодометричним методом, або за допомогою діетилдитіокарбомату натрію, що кількісно розкладає мідні сполуки амінокислот, даючи при цьому жовте забарвлення. Оптичну густину забарвленого розчину визначають колориметрично. Лінійна залежність між вмістом більшості амінокислот спостерігається в межах від 1 до 30 мікрограмів амінного азоту.

Обладнання та реактиви: Ваги технохімічні, фарфорова ступка з товкачиком, штатив із пробірками, лійка, фільтр, хімічний стакан, мірні циліндри, колби мірні на 1 л, 500 і 100 мл, піпетки градуйовані, пробірки градуйовані, скляні палички, водяна баня, центрифуга, ФЕК, 2,73 %-ий розчин хлориду міді (ІІ), 2,56 %-ий розчин гідроортофосфату натрію (25,6 г Na₂HPO₄ розчинити у воді та довести об’єм до 1 л), 1 н розчин гідроксиду натрію, 2 %-ий розчин диетилдитіокарбомату натрію, аміловий або бутиловий спирт, 50 %-ий і 2 %-ий розчини трихлороцтової кислоти, дистильована вода, рослинний матеріал. 

Хід роботи. Наважку свіжих листків або інших вегетативних органів рослин масою 5-10 г зафіксувати киплячим аміловим або бутиловим спиртом і ретельно розтерти в ступці. Потім наважку перенести в хімічний стакан на 100 мл. Ступку змити невеликими порціями води (загальний об’єм суспензії в стакані не повинен перевищувати 40 мл). Стакан із суспензією нагрівати на киплячій водяній бані впродовж 1 год.

При аналізі борошна взяти наважку близько 5 г, перенести її в хімічний стакан, залити 40 мл води, ретельно перемішати та витримати на водяній бані при 40-50⁰ С упродовж 1 год., періодично помішуючи скляною паличкою.

Потім провести осадження білків додаванням у хімічний стакан           5 мл 50 %-ого розчину трихлороцтової кислоти. Вміст стакана відфільтрувати в мірну колбу на 100 мл, осад на фільтрі промити          20 мл 2 %-ого розчину трихлороцтової кислоти, вміст колби довести водою до мітки та перемішати.

У пробірку внести 1 мл досліджуваного розчину, що містить 10- 60 мкг амінного азоту, додати 2,5 мл розчину гідроортофосфату натрію та 2,5 мл суспензії фосфорнокислої міді. Паралельно приготувати контрольну пробу, в якій у пробірку замість досліджуваного розчину додати 1 мл води. Суспензію фосфорнокислої міді отримати наступним чином. Спочатку готують розчин ортофосфату натрію (Na₃PO₄), для чого розчинити 25,6 г Na₂HPO₄ в 500 мл дистильованої води, додати 180 мл 1 н розчину NaОН і довести об’єм водою до 1 л. До одного об’єму одержаного розчину Na₃PO₄ додати один об’єм розчину хлориду міді (ІІ) (27,3 г CuCl₂ розчинити в 1 л) і суміш добре перемішати. Після цього долити чотири об’єми  2,56 %-ого розчину Na₂HPO₄ і нагрівати зі зворотнім холодильником упродовж години. Суспензію фосфорнокислої міді необхідно готувати не менш як за 24 год. до її використання; строк зберігання 1-2 місяці.

Після додавання суспензії фосфорнокислої міді суміш у пробірках добре збовтати та залишити на 30 хв. (за цей час проходить реакція між міддю та амінокислотами). Потім видалити залишок міді. Для цього рідину відфільтрувати через щільний фільтр у чисту суху пробірку або відцентрифугувати при 10 тис. об./хв. упродовж 15 хв., що забезпечує повне видалення з розчину слідів осаду фосфорнокислої міді, котра може вплинути на результати.

Після видалення міді половину фільтрату або 3 мл надосадової рідини перенести в градуйовану пробірку. Рідину в пробірці долити водою до 8 мл, додати 0,1 мл 2 %-го розчину діетилдитіокарбомату натрію, довести водою до 10 мл і добре перемішати. При цьому з’являється жовте забарвлення.

Після 10-хвилинного витримування сполуку, що дає жовте забарвлення, екстрагувати 10 мл амілового або бутилового спирту. Суміш відцентрифугувати при 10 тис. об./хв. упродовж 15 хв. і оптичну густину одержаного жовтого розчину визначити на ФЕКу з синім світлофільтром. Паралельно визначити оптичну густину контрольної проби, в якій замість розчину, що досліджується, була прилита вода.

Вміст амінного азоту визначити за знайденою величиною оптичної густини, використовуючи калібрувальну криву.

При розрахунках величину оптичної густини контрольного розчину віднімають від величини оптичної густини досліджуваного розчину.

    

КОНТРОЛЬНІ ПИТАННЯ

1. Поняття про амінокислоти, їх різноманітність у рослинних організмах.

2. Класифікація амінокислот.

3. Хімічна будова основних протеїногенних амінокислот.

4. Фізико-хімічні властивості амінокислот.

5. Загальні хімічні властивості амінокислот.

6. Якісні реакції на амінокислоти.

7. Принцип мікрометоду визначення вмісту амінного азоту мідним способом у рослинному матеріалі.

 

 

Лабораторне заняття № 6

Тема: Розподіл амінокислот методом хроматографії на папері. Якісні реакції на білки та їх фізико-хімічні властивості

Мета заняття: Засвоїти методику якісного визначення амінокислот методом хроматографії на папері; проробити якісні реакції на білки та з’ясувати їх характерні фізико-хімічні властивості

 

ТЕОРЕТИЧНА ЧАСТИНА

Білки разом із нуклеїновими кислотами є обов’язковими компонентами організмів. Вони входять до складу всіх без винятку живих тіл – починаючи від найпростіших вірусів і закінчуючи людиною. В організмі рослин білки складають 20-25 % у перерахунку на суху масу.

У тілі рослин білки виконують ряд важливих функцій:                    1) будівельну або структурну (входять до складу клітинної мембрани, становлять основу гіалоплазми протопласта, беруть участь у побудові всіх його органел); 2) каталітичну (всі ферменти є простими або складними білками); 3) рухову (забезпечують рух джгутиків у статевих клітинах та зооспорах, рух цитоплазми в клітині, переміщення хромосом під час поділу клітини); 4) транспортну (здійснюють перенесення речовин через клітинну оболонку та мембрани, транспортують фітогормони); 5) захисну (отруйні та токсичні речовини, що забезпечують захист рослин від інших організмів, можуть мати білкову природу); 6) запасаючу (можуть відкладатися в рослинних клітинах як запасні речовини);                        7) рецепторну (окремі групи білків, насамперед глікопротеїни, вибірково впізнають і зв’язують інші речовини); 8) регуляторну (спеціальні білки впливають на активність генів, можуть бути активаторами або інгібіторами ферментів).

Білки представляють собою високомолекулярні гетерополімерні сполуки, що побудовані з залишків α-амінокислот, які сполучені між собою пептидними (амідними) зв’язками. До складу білків входить, як правило, 20 протеїногенних амінокислот або їх форм. Порядок сполучення конкретних амінокислот у поліпептидному ланцюгу білка визначає його первинну будову. В свою чергу вона задає його вторинну та третинну, а для окремих білків – і четвертинну будови. Прості білки складаються лише з амінокислот, а складні білки містять ще й інші компоненти – вуглеводи, ліпіди, ортофосфорну кислоту, йони металів і ін.

Фізико-хімічні та хімічні властивості конкретного білка визначаються як наявністю багатьох пептидних зв’язків, так і природою амінокислот, які входять до його складу.

Білки представляють собою поліелектроліти й тому здатні рухатись в електричному полі. Сумарний заряд білкової макромолекули залежить, насамперед, від її амінокислотного складу та значення pH середовища. Значення pH, при якому сумарний заряд макромолекули дорівнює нулю й вона не здатна до руху в електричному полі, називається ізоелектричною точкою.

Кислотно-основні властивості білків визначаються, головним чином, бічними радикалами амінокислот, здатними до йонізації. Внесок кінцевих NH₂- і COOH-груп досить невеликий. Білки, маючи амфотерні властивості, виконують роль буферів.

Переважна більшість білків є гідрофільними речовинами та розчинними у водних розчинах. Розчинність їх, як і інших високомолекулярних речовин, визначається природою тих груп, які опиняються на поверхні молекули при її просторовій укладці. Більша частина білкової макромолекули утворена групами, здатними до гідратації. Розчинність білків у воді зростає при додаванні невеликих кількостей нейтральних солей (Na₂SO₄, MgSO₄, (NH₄)₂SO₄ та ін.); цей ефект називають сольовим розчиненням. Високі концентрації нейтральних солей, навпаки, осаджують (висалюють) білки з водних розчинів і найбільш активно це відбувається в ізоелектричній точці білка. Розчинність білків залежить також від величини рH розчинника, його складу, температури.

У розчинах білки проявляють колоїдні властивості: вони повільно дифундують, не проходять через напівпроникний бар’єр, розсіюють світло, характеризуються високою в’язкістю. Завдяки гідрофільним і гідрофобним групам, білки можуть впливати на розчинність інших речовин, виступаючи в ролі емульгаторів.

Білки піддаються денатурації. Під денатурацією розуміють порушення нативної просторової структури білкової молекули, що зумовлює зменшення або повну втрату її розчинності, зміну інших фізико-хімічних властивостей білка, втрату специфічної біологічної активності. В результаті денатурації порушуються нативна третинна та, в значній мірі, й вторинна структури. Денатурацію білкових молекул викликають як деякі хімічні речовини (формамід, органічні речовини, йони важких металів, йонні детергенти та ін.), так і фізичні (нагрівання, високий тиск, різні види випромінювань) фактори.

Усі білки, як правило, поглинають ультрафіолетове світло. Вони є оптично активними речовинами та повертають при пропусканні через них плоскополяризоване світло.

При нагріванні з концентрованими кислотами білки піддаються гідролізу, внаслідок чого розриваються пептидні зв’язки та утворюється суміш амінокислот. Подібно до вільних амінокислот білки дають специфічні кольорові реакції, що обумовлені присутністю в їх складі відповідних амінокислот.

 

ПРАКТИЧНА ЧАСТИНА

⇐ Предыдущая10111213141516171819Следующая ⇒

Поделиться: