Визначення активності тирозинази

Принцип методу. Тирозиназа або монофенол-монооксигеназа (К.Ф. 1.14.18.1) широко розповсюджена в рослинах. Вона міститься в картоплі, цукровому буряку, багатьох плодових культурах, у зернах злаків та інших рослинах. Активна тирозиназа міститься в зерні жита та в окремих сортах пшеничного борошна. Темний колір житнього хліба частково пояснюється саме дією тирозинази; цією ж причиною пояснюється потемніння макаронів при сушінні.

Тирозиназа – фермент, який містить мідь і відноситься до типових оксидаз. Для її дії необхідна наявність вільного кисню. Тирозиназа каталізує окислення тирозину, фенолів, пірокатехіну, крезолів, пірогалолу та інших сполук.

При дії на тирозин тирозиназа каталізує двостадійну реакцію гідроксилювання з наступним дегідруванням. Тирозин, окислюючись, перетворюється в дигідроксифенілаланін, а потім у дофахінон. Після цього можливе протікання реакції перетворення дофахінону в дигідроксиіндол і в індол-5,6-хінон, а внаслідок конденсації двох останніх продуктів утворюється димер, до якого можуть окислювальним шляхом приєднуватися наступні дигідроксиіндольні ланки з утворенням, у кінцевому результаті, високополімерних темнозабарвлених сполук – меланінів. Потемніння очищеної картоплі, розрізаного цукрового буряка, розрізаних плодів пояснюється утворенням меланінів під дією тирозинази в присутності кисню повітря.

Тирозиназу, що міститься в рослинному матеріалі, вилучають водою. У водну витяжку, що містить фермент, вносять певну кількість тирозину та інкубують у термостаті при 40⁰ С. Під час інкубації частина тирозину перетворюється в темнозабарвлений пігмент – меланін. Після цього фермент інактивують нагріванням розчину до кипіння, а меланін осаджують хлоридом барію в присутності соди. В фільтраті визначають кількість неокисленого тирозину броматометричним методом. Для визначення кількості тирозину в розчин вносять надлишок 0,03 н розчину бромат-бромідної суміші, підкислюють соляною кислотою й залишають на 10 хв. При цьому відбувається бромування тирозину. Надлишок брому відтитровують розчином метилоранжу, який руйнується й знебарвлюється під дією брому.

Титрування ведуть до появи червоного забарвлення, що не зникає та обумовлене надлишком метилоранжу. Нормальність розчину метилоранжу встановлюють за титрованим розчином бромат-броміду. Молярна маса бромату калію (КВrO₃) дорівнює 167,00, молярна маса тирозину С₆Н₄(ОН)СН₂СН(NН₂)СООН дорівнює 181,19.

Обладнання та реактиви: Піпетки градуйовані, ступка з товкачиком, колби мірні на 50 мл, 100 мл, 200 мл і 1 л, колби конічні на 250 мл, хімічний стакан, лійка, фільтр, бюретки, крапельниця, центрифуга, термостат, годинникове скло, годинник, прожарений пісок, толуол, 0,05 %-ий розчин тирозину (0,1 г тирозину перенести в мірну колбу на 200 мл, додати 1,2 мл 5 %-ого розчину Nа₂СО₃, долити 150 мл дистильованої води, нагріти до розчинення тирозину, а потім охолодити, довести водою до мітки й перемішати; зберігати в темній посудині в холодильнику), 0,03 н розчин бромат-броміду (зважити на аналітичних вагах 0,8349 г КВrО₃, перенести в мірну колбу на 1 л, додати 10 г КВr, розчинити у воді, розбавити водою до 1 л і старанно перемішати), 0,2 %-ий розчин метилоранжу (зважити 2,0 г метилоранжу, перенести в мірну колбу на 1 л, долити дистильованої води, перемішати й довести водою до мітки, розчин відфільтрувати), 10 %-ий розчин хлориду барію (10 г ВаСl₂х2Н₂О перенести в мірну колбу на 100 мл, розчинити в дистильованій воді, довести водою до мітки й перемішати), 5 %-ий розчин карбонату натрію (50 г безводної солі Nа₂СО₃ перенести в мірну колбу на 1 л, розчинити в дистильованій воді й довести водою до 1 л), розчин соляної кислоти (з розведенням 1:1) (50 мл концентрованої соляної кислоти перенести в мірну колбу на 100 мл, довести водою до мітки й перемішати).

 Нормальність приготовленого розчину метилоранжу встановлюють за броматом калію. Для цього в колбу для титрування перенести точно 10 мл 0,03 н розчину бромат-броміду, додати 30 мл дистильованої води, 4 мл розчину соляної кислоти (з розведенням 1:1) і відтитрувати розчином приготовленого метилоранжу до появи червоного забарвлення, що не зникає. Нормальність (N) розчину метилоранжу розрахувати за формулою

 

 10 · 0,03    0,3

N = ———— = —— ,

V             V

де V – об’єм розчину метилоранжу, затраченого на титрування 10 мл 0,03 н розчину бромат-броміду, мл.

Хід роботи. На технохімічних вагах відважити 2-5 г свіжого рослинного матеріалу та перенести його в фарфорову ступку й ретельно розтерти з невеликою кількістю дистильованої води. Якщо матеріал розтирається погано, то в ступку додати невелику кількість прожареного піску. Після розтирання суспензію перенести в мірну колбу на 50 мл, споліскуючи ступку невеликою кількістю води. Вміст колби довести водою до мітки, ретельно перемішати й дати осаду осісти, а потім відфільтрувати. Якщо осад осаджується погано, то його відцентрифугувати впродовж 15 хв. при 5 тис. оберт./хв. Відібрати піпеткою 10 мл прозорої рідини над осадом або 10 мл фільтрату та перенести в конічну колбу на 250 мл. У колбу додати 10 мл розчину тирозину, 2-3 краплі толуолу, поставити колбу в попередньо нагрітий до 40⁰ С термостат і витримати при цій температурі 2 год. За час інкубації під дією тирозинази, що міститься в рослинному матеріалі, проходить окислення частини внесеного тирозину в меланіни.

Після закінчення інкубації в колбу додати 1 мл розчину карбонату натрію, 3 мл розчину хлориду барію, нагріти до кипіння й відфільтрувати через паперовий фільтр у колбу для титрування. Колбу, де проводилось осадження, та осад на фільтрі промити 3 рази гарячою водою порціями по 8-10 мл. Фільтрат охолодити, додати      10 мл бромат-бромідного розчину та 4 мл розчину соляної кислоти, накрити колбу годинниковим склом, перемішати та залишити на        10 хв. Надлишок брому відтитрувати розчином метилоранжу до появи червоного забарвлення, що не зникає. Щоб уникнути втрат брому при титруванні, після додавання наступної порції метилоранжу перемішувати вміст колби коловими рухами без енергійного збовтування.

Паралельно провести контрольний дослід. Для цього 10 мл досліджуваного розчину, отриманого при фільтруванні або центрифугуванні, перенести в колбу для титрування, додати 25 мл дистильованої води та кип’ятити 5 хв. для інактивації ферменту. Після охолодження в колбу додати 10 мл розчину тирозину, 10 мл бромат- бромідного розчину, 4 мл розчину соляної кислоти, накрити колбу годинниковим склом, перемішати вміст колби й залишити на 10 хв. Після цього вміст колби відтитрувати розчином метилоранжу до появи червоного забарвлення, що не зникає. 

Активність тирозинази розрахувати за формулою

166,8 · 50 · N · (V_e – V_k)     417,0 · N · (V_e – V_k)

E = ——————————— = ————————— ,

  10 · m · 2                                  m

де Е – активність тирозинази, мкмоль окисленого тирозину за 1 год. на 1 г досліджуваного матеріалу; 50 – загальний об’єм досліджуваного розчину, мл; 10 – об’єм досліджуваного розчину, що взятий для визначення активності ферменту, мл; 2 – час взаємодії ферменту з тирозином, год.; V_e – об’єм розчину метилоранжу, витраченого на титрування дослідного розчину, мл; V_k – об’єм розчину метилоранжу, витраченого на титрування контрольного розчину, мл; N – нормальність титрованого розчину метилоранжу; m – наважка досліджуваного матеріалу, г; 166,8 – коефіцієнт перерахунку мг нормального розчину тирозину в мікромолі (30 200 : 181,2 = 166,8).

 

КОНТРОЛЬНІ ПИТАННЯ

1. Роль ферментів в обміні речовин у рослинних організмах.
2. Поняття про ферменти, їх природа та загальні властивості.
3. Механізм дії ферментів. Фермент-субстратний комплекс.
4. Вплив різних факторів на швидкість ферментативних реакцій.
5. Одиниці активності ферментів.
6. Класифікація ферментів.
7. Принцип методу визначення активності каталази методом                  О.М. Баха та А.І. Опаріна в рослинному матеріалі.
8. Принцип методу визначення активності тирозинази в рослинному матеріалі.

 

Лабораторне заняття № 9

Тема: Якісне та кількісне визначення нуклеїнових кислот

Мета заняття: Засвоїти методики виділення нуклеопротеїнів, їх якісного та кількісного визначення.

 

ТЕОРЕТИЧНА ЧАСТИНА

Нуклеїнові кислоти, як і білки, є обов’язковими речовинами всіх живих організмів. Не зважаючи на те, що вони були відкриті ще в 1868 р. (швейцарський дослідник Ф. Мішер виділив їх уперше з ядер лейкоцитів людини), їх біологічна роль остаточно була з’ясована лише в 40-50-х роках минулого століття.

Відомо два типи нуклеїнових кислот – дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК) та рибонуклеїнова кислота (РНК). Функцією ДНК є зберігання та відтворення спадкової інформації. РНК забезпечує безпосередню реалізацію цієї інформації у процесі росту та розвитку організму. При цьому виділяють декілька типів РНК, які відрізняються функціями, розміром, складом і локалізацією: матрична або інформаційна РНК (переносить інформацію від ДНК до білоксинтезуючого комплексу); транспортна РНК (транспортує амінокислоти до білоксинтезуючого комплексу); рибосомальна РНК (входить до складу рибосом).     

За хімічною природою нуклеїнові кислоти представляють собою гетерополімери, мономерами яких є нуклеотиди. В свою чергу нуклеотид складається з трьох компонентів – залишків пентози, азотистої основи та ортофосфорної кислоти. Пентоза представлена рибозою (в РНК) або 2'-дезоксирибозою (в ДНК) у β-D-фуранозній формі. Азотисті основи представлені п’ятьма різними сполуками, з яких тимін, цитозин і урацил належать до піримідинів, а гуанін і аденін – до пуринів. Гуанін, аденін, цитозин входять до складу як ДНК, так і РНК. Тимін зустрічається лише в складі ДНК, а урацил – лише в складі РНК. Крім названих азотистих основ у складі нуклеїнових кислот зрідка у невеликих кількостях зустрічаються деякі інші азотисті основи, що називаються мінорними, наприклад,                  5-метилцитозин, тіоурацил, гіпоксантин та ін. У складі нуклеїнових кислот усі оксопохідні азотисті основи присутні в формі лактамів.

У молекулі нуклеотиду пуринові азотисті основи через 9-й атом, а піримідинові – через 1-й утворюють N-глікозидний зв’язок із рибозою або 2'-дезоксирибозою.

Для нуклеїнових кислот, як і для білків, виділяють первинну, вторинну й третинну структури. Первинна структура представляє собою послідовність чергування нуклеотидів у полінуклеотидному ланцюгу. Нуклеотиди сполучаються в макромолекулу нуклеїнової кислоти за рахунок 3',5'-фосфодиефірного зв’язку, що з’єднує C-3' атом D-рибози (або 2'-дезоксирибози) одного нуклеотиду з С-5' атомом іншого. 5'-ОН кінцева група нуклеотиду вважається початком молекули, а 3'-ОН кінцева група – її кінцем.

Вторинна структура ДНК утворює подвійну спіраль із двох антипаралельних полінуклеотидних ланцюгів. При цьому ланцюги закручені один навколо іншого, їх вуглецево-фосфатні групи розміщуються зовні, а азотисті основи – всередині. Азотиста основа одного з ланцюгів утворює комплементарну пару з азотистою основою іншого ланцюга. Така комплементарність забезпечується за рахунок виникнення водневих зв’язків між парою нуклеотидів. При цьому між гуаніном і цитозином виникає три водневих зв’язки, а між аденіном і тиміном – два водневі зв’язки.

Залежно від особливостей вторинної структури відомі декілька форм ДНК – правозакручені (В-, А-, С-форма), лівозакручена                   (Z-форма), незакручена (SBS-форма). З цих форм найчастіше зустрічається В-форма, в якій на один виток спіралі припадає 10 пар нуклеотидів, крок спіралі становить 3,4 нм, діаметр 2,0 нм.

Вторинна структура РНК виникає внаслідок закручування полінуклеотидного ланцюга на себе та утворення в полінуклеотидних ділянках коротких двоспіральних “шпильок”, у яких азотисті основи утворюють комплементарні пари.

Третинна структура ДНК виражається в багаторазовій суперспіралізації молекули, однак в евкаріотичних організмів вона підтримується в комплексі з гістоновими та негістоновими білками. Такі комплекси зумовлюють утворення хромосом. В організації хромосом виділяють декілька рівнів – нуклеосомний, соленоїдний і петлеподібний.

Молекули РНК також мають складну просторову структуру. Так, усі транспортні РНК нагадують “листок конюшини”. Рибосомні РНК мають V- або Y-подібну форму.

Полінуклеотидний ланцюг несе багато фосфатних груп, які легко дисоціюють, унаслідок чого він набуває від’ємного заряду. Тому нуклеїнові кислоти в клітині найчастіше сполучені з основними білками й утворюють нуклеопротеїни.

Нуклеїнові кислоти є речовинами білого кольору, погано розчинними у воді. Однак, вони розчинні в розчинах солей. Для нуклеїнових кислот характерна висока оптична активність і їх розчини здатні обертати площину поляризованого світла. Всі нуклеїнові кислоти мають здатність поглинати світло в ультрафіолетовій області з максимум 260 нм. Нуклеїнові кислоти також піддаються денатурації, при якій відбувається розрив водневих зв’язків і порушення вандерваальсових взаємодій. Унаслідок цього деспіралізуються й розходяться полінуклеотидні ланцюги ДНК і двоспіральних ділянок РНК.

У зв’язку з наявністю азотистих основ і пентоз у складі нуклеїнових кислот, які містять різні функціональні групи, вони можуть вступати в різні хімічні реакції. Нуклеїнові кислоти під впливом кислот піддаються гідролізу.

Якісні реакції на нуклеїнові кислоти та методи кількісного визначення вмісту їх окремих типів ґрунтуються на хімічних властивостях складових компонентів цих сполук.

 

ПРАКТИЧНА ЧАСТИНА

⇐ Предыдущая12131415161718192021Следующая ⇒

Поделиться: