Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология
Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии


Тема занятия.  Иммунологические методы диагностики.



Тема занятия.  Иммунологические методы диагностики.

2. Мотивация изучения темы. Прикладное значение иммунологии складывается из нескольких направлений. Одно из них — применение иммунологических реакций для лабораторной диагностики различных инфекций с поиском и индикацией антител и антигенов в различных биосубстратах от больного. В зависимости от особенностей иммунологических реакций их подразделяют на адсорбционно-агглютинирующие, преципитационно-нейтрализующие и лизирующие варианты. Они различаются по характеру антигена (корпускулярный, растворимый и пр.), условий, необходимых для их взаимодействия (наличие электролита, комплемента, сорбента, индикатора и пр.).

Диапазон применения этих реакций огромен, от санитарно-гигиенического контроля, определения фальсификации продуктов, диагностики до судебной экспертизы. Знакомство с ними – главное назначение темы.

 

Цели занятия.

3.1. Общая цель: Общая цель: изучение темы направлено на формирование компетенций по ФГОС-03 по специальности 31.05.01. – Лечебное дело: формировать способность и готовность использовать на практике методы гуманитарных, естественнонаучных, медико-биологических и клинических наук в различных видах профессиональной и социальной деятельности, формировать умение работать с научной литературой, анализировать информацию, вести поиск, выделять основные положения, делать выводы, развивать личностные качества. Активно использовать современные достижения науки, особенно подчеркивая роль отечественных ученых в разработке данной темы, знать и владеть основными методами определения и оценки общей иммунологической реактивности, навыками интерпретации их результатов (ПК-22).

3.2.Конкретные цели и задачи. После изучения темы студент должен

I уровень - «иметь представление» - о антигены и антитела, иммунологических реакциях, понимать их сущность,

II уровень -  «Знать» - антигены и антитела, их биохимические основы, функции и назначения, технику постановки реакций, особенности расшифровки результатов всех вариантов.        

III уровень -  «Уметь» - Освоить (на уровне умения) технику постановки иммунологических реакций, понимать их сущность, особенности расшифровки результатов всех вариантов

IV уровень - «Владеть» -  работой с лабораторными приборами и оборудованием, техникой постановки (РА, РП, РСК) и расшифровке результатов обследования пациентов с помощью современных иммунодиагностических проб. Умением сопоставлять факты, делать выводы, развивать личностные качества. Стремиться использовать современные достижения науки, отечественных ученых

 

Ориентировочная основа действия (ООД) для проведения практического занятия (курация, выполнение лабораторной работы и т.д.).

1. 1Подготовить к проверке материалы по самоподготовке (письменные ответы на вопросы домашнего задания, лекции по теме занятия).

2. Сформулировать цель занятия.

3. Контроль исходного уровня знаний.

4. Составить алгоритм реакций

5. Поставить РА, РП, РИФ (по выбору педагога)

6. Контроль итогового уровня знаний.

Задания для контроля уровня сформированности компетенций в учебное время.

Тестовый контроль итоговый

 

1. .Как исключить групповую РА:

а) повторить РА через 3-4 дня по нарастанию титра

б) поставить РА по Кастеллани

в) заменить физиологический раствор в РА на гипертонический по Фишеру

г) все перечисленное верно

 

2. Как уточнить диагноз болезни с помощью иммунологической реакции:

а) повторить реакцию через 3-4 дня - по нарастанию титра

б) поставить РА по Манчини

в) заменить физиологический раствор в РА на дистиллированную воду

г) все перечисленное верно

 

3. Какая из перечисленных реакций не относится к иммунологическим?

а) РА

б) РТГадс

в) РГадс

г)ПЦР

 

4. Какую реакцию следует отнести к ускоренно - ориентировочной?

а) РИФ

б) РНГА

в) РИТ

г) серотипирование в РА на стекле

 

5. В чём преимущества РНИФ перед РИФ?

а) более широкие диагностические возможности

б) дешевизна

в) доступность

г) скорость получения ответа

 

6. Для постановки РСК в качестве источника комплемента обычно используется:

   а) сыворотка крови барана

   б) сыворотка крови морской свинки

   в) сыворотка крови человека

г) любая свежая сыворотка

7. К реакциям с использованием меченых АТ не относят:

  а) РА

  б) радиоиммунный анализ

  в) ИФА (иммуноферментный)

  г) РИФ

 

8. При «положительной» РА наблюдается эффект:

   а) хлопья (зерна) с просветлением суспензии

   б) помутнение

   в) задержка гемолиза

   г) гемолиз

9. При «положительной» РНГА наблюдается эффект:

   а) хлопья (зерна) с просветлением суспензии

   б) помутнение

   в) задержка гемолиза

   г) «зонтик»

10. При «положительной» ИФА наблюдается эффект:

   а) хлопья (зерна) с просветлением суспензии

   б) помутнение

   в) изменение окраски в лунке планшета

   г) гемолиз

       

7. . Задания для самостоятельной подготовки к практическому занятию:

7.1. Перечень контрольных вопросов для самоконтроля знаний.

1. 1.Сущность реакций антиген-антитело (феномены и силы взаимодействия, роль концентрации реагентов, специфичность реакций).

2. Биологическое назначение и активность иммунных комплексов, фазы элиминации антигена из организма.

3. Иммунологические реакции агглютинации — РА, сущность, условия, техника постановки, назначение, варианты:

- РА классическая, развёрнутая по Видалю, Райту

- РА ориентировочные по Ноблю, Хеддльсону, Минкевичу, Кастеллани.

4. РГА, реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) и реакция торможения гемагглютинации (РТГА).

5. Реакция гемадсорбции в культуре ткани (РГадс) и её торможения (РТГадс).

6. Реакция иммобилизации трепонем (РИТ).

7. Реакция иммунофлюоресценции прямая — (РИФ), непрямая — (РНИФ), техника, условия, реагенты.

8. Применение иммунологических реакций адсорбционно-агглютинирующего типа в медицине.

9.Комплемент, его структура, функции, участие в иммунных реакциях лизиса.

10. Классический и альтернативный путь активации.

11. Реакция гемолиза, сущность, техника, назначение как индикатора.

12. Реакция бактериолизиса ин витро. Ингредиенты, схема постановки, правила учета.

13. Реакция бактериолизиса ин виво (феномен Исаева-Пфейффера).

14. Реакция связывания комплемента (РСК): определение титра и рабочей дозы комплемента, антигена, гемолитической сыворотки, схема постановки реакции, этапы, оценка результатов. РТСК, сущность, назначение.

15. Реакция нейтрализации токсина антитоксином. Определение токсина, его силы, титра антитоксической сыворотки, варианты постановки реакций: ин витро – флокуляция, ин виво.

16. Варианты постановки реакции нейтрализации в вирусологии; на лабораторных животных, в культуре ткани, на развивающихся куриных эмбрионах. Особенности учёта, индикаторы.

17. Реакции преципитации в пробирках, капиллярах, геле. Приготовление антигена.

18. Иммунологические реакции с меченными диагностическими компонентами: иммуноферментный метод диагностики (ИФА), радиоиммунный метод (РИМ), иммуноблоттинг (ИБ).

19. Критерии серо- или иммунодиагностики: диагностический титр, нарастание титра антител, специфическое подавление (торможение).

20. Определение периода болезни с помощью иммунодиагностики (раздельное определение иммуноглобулинов М и G) с учетом сроков и уровня их появления.

7.2.Задания для СРС во внеучебное время

1. При подготовке к практическому занятию студент в рабочей тетради заполняет протокол практического занятия по теме (зарисовывает препараты, составляет комплексные таблицы, развернутые схемы, заключения и т.д.).

Приложение 2

Приложение 2а

Приложение 3

Приложение 4

Приложение 5

Приложение 6

КРОВЯНО-КАПЕЛЬНАЯ РЕАКЦИЯ МИНКЕВИЧА (РА)

Принцип метода: основан на использовании для РА цельной крови без отделения кровяных клеток, но с их предварительным лизисом под влиянием дистиллированной воды.

На обезжиренное предметное стекло нанести каплю крови и каплю дистиллированной воды. В капле образовавшегося гемолизата эмульгировать каплю диагностикума. Покачивая стекло, учесть наступившую реакцию. Контролем служит физ. раствор с диагнустикумом.

При этом в опытной капле — на фоне красного гемолизата видны белые хлопья агглютината (сначала по периферии, затем — по всей капле). В контроле наблюдается общее помутнение.

Приложение 7

ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) РЕАКЦИИ ГЕМАГЛЮТИНАЦИИ (РНГА ИЛИ РПГА)

Принцип РНГА основан на способности эритроцитов адсорбировать на своей поверхности микробные антигены. Сенсибилизированные таким образом эритроциты агглютинируются в присутствие гомологичной для антигена сыворотки с антителами. При этом реакция идёт между микробным антигеном и антителами, а эритроциты пассивно через них вовлекаются в этот процесс. Для постановки РНГА необходимы эритроциты, обработанные танином, на которых адсорбированы специфические антигены возбудителя. Антигенами в РНГА могут служить очищенные антигены соответствующих микробов, экстракты бактериальных взвесей, надосадочные жидкости формалиновых, спиртовых, гретых бактериальных вакцин, вирусов. Реакцию ставят в агглютинационных пробирках или в лунках иммунологического планшета.

 

 

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ

Ингредиенты

 

Разведение сыворотки

 

Контроли антигена

 

1:10 1: 20 1: 40 1: 80 1: 160 1:320 1:640 1:2800 На спон-танную агглюти-нацию На специфич- нось реакции
Физ. раствор, в мл   0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 - -
Испытуемая сыворотка в разведении 1:5 в мл, инактивированная 30мин при +56 C° 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 вылить   - -
Эритроцитарный диагностикум, в мл 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Контрольная положительная сыворотка - - - - - - - - - 0.5
Контрольная отрицательн-ая сыворотка - - - - - - - - 0.5 -
Результат (пример) ++++ ++++ ++++ +++ ++ + - - ++++ -

 

Результаты реакции учитывают через 2 часа инкубации при + 37Сº и вторично — через 24 часа стояния при комнатной температуре. Их оценка зависит от характера осадка эритроцитов.

+ + + + Резко положительная реакция: эритроциты равномерно покрывают всю лунку планшета в виде разрыхлённого зонтика с неровными краями
+ + + Положительная реакция: почти все эритроциты агглютинированы и покрывают дно, края неровные
+ + Большинство эритроцитов не агглютинированы, осели на дно, изредка встречаются мелкие хлопья склеенных эритроцитов. Слабая РПГА
- Скопление эритроцитов имеет вид маленького, довольно плотного диска (пуговка).

 

Титром сыворотки считают последнее её разведение, которое вызывает склеивание эритроцитов при полном или почти полном просветлении надосадочной жидкости (2 плюса).

Приложение 8

Приложение 9

Приложение 10

Варианты РИФ

1. Прямой РИФ: препарат, приготовленный из инфицированного материала, фиксируют жидким фиксатором (в ацетоне), обрабатывают антителами, мечеными флюорохромом — изотиоционатом флюоресцеина (ФИТЦ), отмывают от избытка сыворотки и после высушивания рассматривают в люминесцентном микроскопе.

Достоинства метода: простота, специфичность.

Недостатки: необходим большой набор люминесцентных сывороток.

 2. Непрямой РИФ (РНИФ): Используется для обнаружения антител.

Последовательность обработки препарата непрямого РИФ: препарат из инфицированного материала высушить, фиксировать химическим фиксатором, нанести испытуемую сыворотку и инкубировать во влажной камере при + 37Сº 30 минут. Тщательно промыть водой, высушить. Обработать препарат антиглобулиновой сывороткой (против глобулинов человека). Инкубировать при + 37Сº во влажной камере 15 минут. После этого промыть водой, высушить, микроскопировать в люминесцентном микроскопе.

Приложение 11

РАДИОИММУННЫЙ МЕТОД (РИМ)

Сущность метода: метод позволяет в любом биологическом субстрате (моче, крови и т.д.) определять ничтожно малые концентрации растворимых антигенов, продукты метаболизма микроорганизмов, гормоны и пр. на основе конкуренции с радиоактивным антигеном.

Этапы постановки реакции

1. Стандартное количество антигена, идентичного меченому радиоактивной меткой (например, I123, I131, либо другими изотопами) антигену, наливают в пробирку.

2. Добавляют стандартное количество иммунной сыворотки, специфичной антигену. 70- 80% меченного антигена связывается при этом с антителами, образуя радиоактивный преципитат.

3. Добавляют субстрат, исследуемый на присутствие предполагаемого антигена. Если в субстрате есть антиген, идентичный меченному, то он конкурирует с ним, отнимая антитела. Радиоактивность преципитат при этом снижается.

Чем больше в субстрате антигена, тем меньше радиоактивность преципитата.

Приложение 12

Схема постановки основного опыта РСК

Ингредиенты Опыт Контроль сыворотки Контроль антигена на антикомпле-ментарность Контроль антигена на гемотоксичность

Диагностическая система

Сыворотка крови больного, инактивированная при +56 C° 30 мин., мл 0,5 0,5 - -
Антиген в рабочей дозе, мл 0,5 - 0,5 0,5
Комплемент в рабочей дозе, мл 0,5 0,5 0,5 -
Физ. раствор 0,85 % - 0,5 0,5 1,0

Инкубировать в термостате при 37 C° 60 мин.

Приложение 13

      СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (В ПРИСУТСТВИИ АНТИГЕНА)

Ингредиенты

                               Пробирки

Контроли антигена

1 2 3 4 5 6 Гемотокс. Антикомпл
Комплемент 1:10 0,05 0,1 0,12 0,15 0,18 0,25 - 0,25
Физ.раствор, мл 0,45 0,4 0,38 0,35 0,32 0,25 0,5 0,25
Антиген, мл 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин.

Гемолитическая система, мл   0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Инкубировать в термостате при 37С°  40 мин.

Учет результатов

Задержка гемолиза

Гемолиз

Задержка гемолиза Гемолиз

 

Титр комплемента 0,12 (минимальное количество, дающее гемолиз в гемосистеме).

Рабочая доза 0,15 (чуть больше титра, для гарантии).

Приложение 14

Приложение 15

Приложение  16

Приложение 17

Схема постановки РТСК

Ингредиенты   Опыт РСК Контроль положительн. АТ Опыт РТСК
Сыворотка крови больного, инактивирована при + 56 С° 30 минут 0,5 - 0,5
Антиген в рабочей дозе, мл. 0,5 0,5 0,5
Физиол. раствор 0,85 %, мл. - 0,5 -
Комплемент в рабочей дозе, мл. 0,5 0,5 0,5

Инкубировать при + 37С° 45 —60 минут

Заведомо положительная иммунная сыворотка, инактивированная при + 56 С° 30 мин. - 0,5 0,5

Инкубировать при + 37С° 45 —60 минут

Гемосистема (готовая), мл 1,0 1,0 1,0

Инкубировать при + 37С° 45 —60 минут

Результат Гемолиз Гемолиза нет Гемолиз

Условие: у больного есть неполные антитела.

Приложение 18

Приложение 19

Приложение 20

Приложение 22

РАДИОИММУННЫЙ МЕТОД (РИМ)

Сущность метода: метод позволяет в любом биологическом субстрате (моче, крови и т.д.) определять ничтожно малые концентрации растворимых антигенов, продукты метаболизма микроорганизмов, гормоны и пр. на основе конкуренции с радиоактивным антигеном.

Этапы постановки реакции

1. Стандартное количество антигена, идентичного меченому радиоактивной меткой (например, I 123 , I 131, либо другими изотопами) антигену, наливают в пробирку.

2. Добавляют стандартное количество иммунной сыворотки, специфичной антигену. 70- 80% меченого антигена связывается при этом с антителами, образуя радиоактивный преципитат.

3. Добавляют субстрат, исследуемый на присутствие предполагаемого антигена. Если в субстрате есть антиген, идентичный меченому, то он конкурирует с ним, отнимая антитела. Радиоактивность преципитат при этом снижается.

Чем больше в субстрате антигена, тем меньше радиоактивность преципитата.

Приложение 23

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД

Сущность метода:  конъюгат, образованный антителами, фиксированными на стенке лунки полистироловой пластины, и антигеном, взаимодействует с антителами, мечеными ферментом (чаще всего пероксидазой хрена) и также остаются на стенке пробирки. Не фиксированные (не отреагировавшие) субстраты сливаются из лунки и заменяются хромогеном с субстратом для индикации данного фермента. К примеру, хромогеном может служить ортофенилендиамин, субстрат для пероксидаз - перекись водорода.

Если в исследуемом субстрате были антигены, идентичные антителам, то энзим фиксируется на стенке лунки, разлагает перекись водорода и выделившийся кислород окрасит хромоген в желтый цвет.

 

Приложение 24

МЕТОД ИММУНОБЛОТТИНГА

для выявления антител в сыворотках крови больных к определенным антигенам возбудителя

Принцип метода:

1. Разделенный с помощью электрофореза комплекс антигенов в испытуемом субстрате наносят на полоску из нитроцеллюлозы. При этом разные антигены в силу разницы в электрофоретической подвижности располагаются в различных участках полоски.

2. Дальнейшее сравнительное исследование проводят по схеме сопоставления анализируемого образца с эталоном.

Тема занятия.  Иммунологические методы диагностики.

2. Мотивация изучения темы. Прикладное значение иммунологии складывается из нескольких направлений. Одно из них — применение иммунологических реакций для лабораторной диагностики различных инфекций с поиском и индикацией антител и антигенов в различных биосубстратах от больного. В зависимости от особенностей иммунологических реакций их подразделяют на адсорбционно-агглютинирующие, преципитационно-нейтрализующие и лизирующие варианты. Они различаются по характеру антигена (корпускулярный, растворимый и пр.), условий, необходимых для их взаимодействия (наличие электролита, комплемента, сорбента, индикатора и пр.).

Диапазон применения этих реакций огромен, от санитарно-гигиенического контроля, определения фальсификации продуктов, диагностики до судебной экспертизы. Знакомство с ними – главное назначение темы.

 

Цели занятия.

3.1. Общая цель: Общая цель: изучение темы направлено на формирование компетенций по ФГОС-03 по специальности 31.05.01. – Лечебное дело: формировать способность и готовность использовать на практике методы гуманитарных, естественнонаучных, медико-биологических и клинических наук в различных видах профессиональной и социальной деятельности, формировать умение работать с научной литературой, анализировать информацию, вести поиск, выделять основные положения, делать выводы, развивать личностные качества. Активно использовать современные достижения науки, особенно подчеркивая роль отечественных ученых в разработке данной темы, знать и владеть основными методами определения и оценки общей иммунологической реактивности, навыками интерпретации их результатов (ПК-22).

3.2.Конкретные цели и задачи. После изучения темы студент должен

I уровень - «иметь представление» - о антигены и антитела, иммунологических реакциях, понимать их сущность,

II уровень -  «Знать» - антигены и антитела, их биохимические основы, функции и назначения, технику постановки реакций, особенности расшифровки результатов всех вариантов.        

III уровень -  «Уметь» - Освоить (на уровне умения) технику постановки иммунологических реакций, понимать их сущность, особенности расшифровки результатов всех вариантов

IV уровень - «Владеть» -  работой с лабораторными приборами и оборудованием, техникой постановки (РА, РП, РСК) и расшифровке результатов обследования пациентов с помощью современных иммунодиагностических проб. Умением сопоставлять факты, делать выводы, развивать личностные качества. Стремиться использовать современные достижения науки, отечественных ученых

 


Поделиться:



Последнее изменение этой страницы: 2019-04-10; Просмотров: 600; Нарушение авторского права страницы


lektsia.com 2007 - 2024 год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! (0.07 с.)
Главная | Случайная страница | Обратная связь