Определение концентрации спермиев на фотоэлектроколориметре ФЭК-М

Материал и оборудование: сперма, фотоэлектроколориметр, 3,5% раствор натрия цитрата, микропипетки (0,1 см³), мерные пипетки (10 см³), сухие чистые флаконы или пробирки, марлевые салфетки, фильтровальная бумага, смесь этилового спирта и эфира (поровну), дистиллированная вода, чашка толстостенная емкостью 0,5 литра.

Метод определения концентрации спермиев при помощи ФЭК-М основан на способности спермы ослаблять пропускаемый через нее пучок света пропорционально концентрации спермиев, то есть чем выше концентрация спермиев, тем больше ослабляется проходящий пучок света. Величина ослабления светового пучка регистрируется чувствительными фотоэлементами.

Определение концентрации на ФЭК-М начинают спустя 15-20 минут после включения лампы и засветки фотоэлементов. Для повышения точности исследований рукояткой устанавливают красные светофильтры. Левый отсчетный барабан рукояткой выставляют на «0» по красной шкале (шкала оптической плотности).

Во флакон наливают 10 мл 3,5% раствора натрия лимоннокислого и вносят в него 0,1 мл спермы быка (сперма разбавляется в соотношении 1:100). Сперму барана разбавляют в соотношении 1:400, то есть берут 10 мл 3,5% раствора натрия лимоннокислого и 0,025 мл спермы. Сперму хряка разбавляют в соотношении 1:30, то есть к 12 мл 3,5% раствора натрия лимоннокислого добавляют 0,4 мл спермы, которая предварительно должна быть профильтрована через 2 слоя капроновой ткани для отделения студенистого секрета.

Пробы спермы отбирают микропипеткой емкостью 0,1-0,5 мл из середины свежеполученного эякулята. Перед внесением пробы спермы в раствор микропипетку необходимо снаружи вытереть чистой марлевой салфеткой. После внесения спермы в раствор микропипетку надо 2-3 раза прополоскать в этом же растворе путем насасывания и выдувания.

Температура 3,5% раствора натрия лимоннокислого должна быть в пределах 18-25^оС.

После разбавления сперму тщательно перемешивают и наливают в кювету с рабочей длиной 10 мл до метки и быстро определяют оптическую плотность. Для этого на путь прохождения пучка света ставят в левый кюветодержатель чистую кювету с рабочей длиной 10 мм, наполненную 3,5% раствором натрия лимоннокислого, а в правый кюветодержатель - 2 такие же кюветы: одну с разбавленной спермой, другую с 3,5% раствором натрия лимоннокислого. При этом кювету с разбавленной спермой устанавливают на пути прохождения пучка света (как и в левом кюветодержателе), а кювету с раствором в запасное гнездо этого же кюветодержателя. Кюветы необходимо устанавливать перпендикулярно к пучку света.

Закрывают крышку прибора и включают гальванометр рукояткой сначала на грубую чувствительность в положение «1». Рукояткой нейтральных клиньев подводят стрелку гальванометра к «0», затем включают гальванометр на высокую чувствительность, в положение «2» и точно устанавливают стрелку на «0». Затем гальванометр сразу же переводят на грубую чувствительность в положение «1». Меняют в правом кюветодержателе местами кюветы так, чтобы на пути прохождения света стала кювета с 3,5% раствором натрия лимоннокислого. Это достигается путем поворота кюветодержателя вокруг оси.

Опустив крышку прибора, опять включают гальванометр сначала на грубую чувствительность (не трогая ручку нейтральных клиньев) рукояткой барабана подводят отклонившуюся стрелку гальванометра на «0». Включают гальванометр на высокую чувствительность, точно устанавливают стрелку на «0». Рукоятку гальванометра переводят в положение «0».

Отсчет берут по красной шкале левого барабана и смотрят, какой величине концентрации он соответствует на калибровочной кривой, которую выводят заранее.

Построение калибровочной кривой. Для определения концентрации спермиев на ФЭК-М необходимо предварительно построить калибровочную кривую, изображающую зависимость оптической плотности от концентрации спермиев.

Для построения калибровочной кривой из свежевзятых эякулятов выбирают несколько таких, в которых концентрация спермиев наиболее высокая. Тщательно определяют концентрацию спермиев в счетной камере.

Из отобранных эякулятов путем разбавления их 3,5% раствором лимоннокислого натрия 1:1, 1:2, 1:3 и т.д. готовят ряд образцов спермы и определяют концентрацию спермиев в каждом из них в счетной камере.

Определяют величину оптической плотности каждого образца на приборе, как описано в предыдущей методике. Зная фактическую концентрацию спермиев, установленную в счетной камере, строят калибровочную кривую. Для этого на миллиметровой бумаге откладывают: по горизонтальной оси - известные концентрации спермиев каждого образца, по вертикальной - соответствующие им величины оптической плотности. В местах пересечения перпендикуляров ставят точки, калибровочную кривую проводят так, чтобы она прошла через большинство указанных точек, а число точек, лежащих выше или ниже калибровочной кривой, было примерно одинаковым.

Кривая не должна быть сильно изогнутой или изломанной.

Имея калибровочную кривую, можно легко определить неизвестную концентрацию спермиев любого эякулята. Для этого нужно лишь установить его оптическую плотность на приборе, как указано выше и посмотреть какой величине концентрации она соответствует на калибровочной кривой. При этом следует строго соблюдать все условия исследования при которых выведена и калибровочная кривая. Надо применять ту же кратность разбавления спермы, использовать кюветы той же рабочей длины, те же светофильтры и тот же способ отсчета величин оптической плотности.

Калибровочную кривую следует ежемесячно проверять, так как показания прибора могут изменяться.

Точность электрофотометрического метода определения концентрации спермиев и источник ошибок. По точности электрофотометрический метод определения концентрации спермиев почти не уступает методу определения в счетных камерах. Величина ошибки колеблется в пределах  ±6%.

Эта величина ошибки обусловлена в основном влиянием плазмы спермы и неточностью взятия проб. Влияние пигментации плазмы на точность результатов исследования ослабляется применением красных монохроматических светофильтров.

Электрофотометрический метод определения концентрации спермиев требует исключительной аккуратности в работе.

Основными источниками ошибок могут быть:

1. Грязные кюветы, флаконы, микропипетки и другие предметы, которые имели контакт со спермой во время ее подготовки к исследованию;

2. Неточность взятия проб спермы микропипетками;

3. Неточность в разбавлении спермы перед исследованием;

4. Всевозможные механические примеси в 3,5%-ном растворе натрия лимоннокислого;

5. Загрязнение оптики прибора в результате неаккуратной работы;

6. Несвоевременность исследования проб спермы, что может привести к их подсыханию или биологическому загрязнению (развитию микрофлоры).

Для получения точных результатов не следует допускать перечисленных недостатков в исследовании. Кювету со спермой после каждого исследования необходимо прополаскивать дистиллированной водой не менее 3 раз. Остатки воды в кювете убирают промокательной бумагой, а для исследования очередного образца спермы берут другую кювету такой же рабочей длины.

Кювету берут только за боковые грани, чтобы не загрязнять рабочие поверхности.

После окончания работы все кюветы тщательно моют дистиллированной водой. Несмываемые водой загрязнения устраняют смесью спирта с эфиром. Для этого используют марлевый тампон, намотанный на деревянную палочку.

Определение концентрации спермиев хряка

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: