Культивирование овариальных ооцитов и оплодотворение вне организма

Вызывание множественной овуляции у коров–доноров, с последующим их оплодотворением и извлечением эмбрионов, предоставляет весьма ограниченные возможности тиражирования материнской части генома. В этой связи возникла идея  использования резерва овариальных ооцитов. 

Незрелые ооциты выделяют их яичников коров, преждевременно выбывших из эксплуатации. Яичники доставляют в лабораторию в термосе с физраетвором (температура 30-35 °С) не позже 1, 5 ч после убоя коровы. Ооциты извлекают из полостных фолликулов, пощих диаметр 2-5 мм, путем вымывания средой Дюльбекко с добавлением гепарина и антибиотика. Вылавливают пастеровской пипеткой под микроскопом МСБ-9 и проводят морфологическую оценку визуальным путем. Извлеченные из фолликулов ооциты инкубируют в висячей капле, под слоем вазелинового ела при температуре 38, 5°С; срок инкубации 24 ч. Используют культуральную среду ТС-199 с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка и гентамицина. Для  ускоренного созревания ооцита в среду добавляют гормоны фоллитропин + лютропин и эстрадиол.

Капацитацию спермиев проводят методом «swin up» с использованием среды p-TALP. Оплодотворение ооцита капацитированными спермиями происходит в среде  Fert-TALP при экспозиции 16-18ч. Зиготу отмывают от прилипших спермиев и переносят для дальнейшего культивирования в среду СДМ с культурой эпителиальных клеток яйцепровода. Срок культивирования — 144-168 ч.

Эмбрионы оценивают по морфологическим признакам, заправляют в пайеты и пересаживают телкам-реципиентам. Приживляемость составляет 20-26%.

Первоначально использовали яичники выбывших из эксплуатации, но ценных в племенном отношении особей: их помещали в термос с физраствором (Т 30-35⁰С) и доставляли в лабораторию не позже 1, 5 ч после убоя коровы. Ооциты извлекали из полости фолликулов, имеющих 2-5 мм в диаметре, путем вымывания средой Дюльбекко, с добавлением гепарина. Однако этот метод не позволил получать ооциты в достаточном количестве.

Позже были разработаны методы получения ооцитов в бό льших количествах от живых коров, без удаления яичников из тела животного. Наиболее приемлемым оказалось извлечение ооцитов путем отсасывания содержимого полостных фолликулов под УЗИ-контролем. Эту процедуру можно повторять через небольшие промежутки времени (1-2 недели) практически неограниченное количество раз.

При проведении работы по прижизненному извлечению ооцитов используют генератор ультразвука оригинальной конструкции: его генерирующая головка и датчик объединены с инъекционной иглой.

Манипуляции по извлечению ооцита проводят под эпидуральной анестезией. Датчик прибора вводят во влагалище; вмонтированной в него иглой прокалывают верхний свод влагалища. Вслед за этим вводят руку в прямую кишку, захватывают яичник и подводят к верхнему своду влагалища, по эхо-изображению на мониторе выбирают нужный полостной фолликул (диаметр 2-8 мм), прокалывают иглой и отсасывают содержимое.

По имеющимся данным, после 16-20 таких операций функция яичников остается ненарушенной, патологических изменений не обнаруживают.

Извлеченный из фолликула ооцит нуждается в дозревании; для этого его помещают на 24 ч в инкубационную среду, куда вносят гормоны (эстрадиол, фоллитропин, лютропин) и клетки гранулезы.

Для оплодотворения дозревшего ооцита требуются капацитированные спермии. Если используется замороженно-оттаянная сперма, то вначале живых спермиев отделяют от мертвых методом отстаивания. Живых спермиев отмывают от среды замораживания и помещают в среду, содержащую капацитирующие факторы (гепарин, лизолецитин) на 18-24 ч, после чего переносят в среду с ооцитом.

Полученная зигота должна пройти развитие вне организма до стадии бластоцисты. Для этого ее помещают в среду с культурой эпителиальных клеток яйцепровода; срок культивирования – 7 суток.

Выход полноценных бластоцист составляет 40%. Этот показатель можно считать вполне приемлемым, поскольку в естественных условиях, т.е. в организме коровы свыше половины полостных фолликулов претерпевает атрезию.

Эмбрионы оценивают по морфологическим признакам, заправляют в пайеты и пересаживают телкам-реципиентам. Приживляемость составляет 20-26%.

 

Глава 4

БЕРЕМЕННОСТЬ

⇐ Предыдущая29303132333435363738Следующая ⇒

Поделиться: