Лиганднообменная хроматография.

Лигандообменная хроматография (ЛОХ), предложенная В.А.Даванковым как вариант ВЭЖХ, также как и ион-парная хроматография основана на динамическом модифицировании. В этом методе неподвижная и (или) подвижная фаза содержат комплексообразующий ион металла и разделение смеси веществ происходит за счет различия в константах комллексообразования веществ и (или) коэффициентах распределения комплексов между подвижной и не­подвижной фазами. Под лигандом понимают нейт­ральную молекулу или анион, связанный с ионом металла коорди­национной связью. Путем обобществления неподеленной электрон­ной пары донорного атома лиганда центральный катион металла достраивает свою электронвую оболочку до структуры, аналогич­ной электронной оболочке атома инертного газа. Если связь лиганд - металл лабильна, один лиганд может замещать другой. Вода также может выступать в роли лиганда, поэтому в случае водных растворов необходимо учитывать координирование молекул воды. Воз­можны ионообменный, ион-парный и обращенио-фазовый вари­анты лигандообменной хроматографии.

Термин “лигандообменная хроматография” (ЛОХ) был введен в 1961 г. Ф. Гельферихом (F.Helfferih), который на обычной колонке, заполненной катионообменной смолой, провел разделение некоторых диаминов. Необходимо было выделить 1, 3-диамино-2-гидроксипропан из разбавленного водного раствора, содержащего также аммиак. Для решения этой задачи стеклянная колонка была заполнена катионообменной смолой, насыщенной голубым комплексом двухвалентной меди с аммиаком (в основном Cu(NH₃)₂²⁺), а затем через нее пропущен исследуемый раствор. В верхней части колонки появлялась интенсивная синяя полоса, расширявшаяся книзу при движении раствора. Появление окраски было обусловлено образованием медного комплекса диамина. Каждая молекула диамина замещала две молекулы аммиака:

Res₂Cu (NH₃)₂ + (диамин) =Res₂Cu (диамин) +2NНз

где Res — функциональная группа катионообменной смолы, в данном случае — карбоксильная группа.

После того как интенсивная синяя окраска распространилась на всю колонку, Гельферих пропустил через колонку незначительное количество концентрированного раствора аммиака, чтобы вытеснить адсорбированный диамин; при этом записанная выше реакция шла в обратном направлении, что приводило колонку в исходное состояние. Медь практически не вымывалась из смолы, ее покидали только лиганды: аммиак и диамин менялись местами. Именно отсюда произошло название «лигандный обмен».

Лигандный обмен можно осуществить с любыми аминами, впрочем, как и с любыми другими веществами, способными образовать лабильные комплексы с ионами меди. Для проведения лигандного обмена можно использовать ионы любого металла, с которым разделяемые соединения образуют лабильные координационные комплексы. Этот процесс применим и в аналитической элюционной хроматографии. Так, например, если ввести смесь аминов в колонку с ионообменником, заряженным ионами металла, а затем пропустить через нее раствор аммиака, то амины будут перемещаться по колонке с различными скоростями: амины, образующие более стабильные комплексы, останутся позади, а амины, входящие в состав менее прочных комплексов, уйдут вперед (рис. 15). Порядок селективности определяется природой иона металлов, ионообменника и элюента.

 

Рис. 15. Схематическое представление лиганднообменной хроматографии.

 

Метод лигандного обмена можно применять и при разделении методом газожидкостной хроматографии. Например, при анализе смеси летучих аминов газ-носитель должен содержать аммиак. В настоящее время лигандный обмен мало используется в газовой хроматографии, хотя давно отработаны методики газохроматографического разделения олефинов на неподвижных фазах, содержащих ионы одновалентного серебра.

Лигандом может быть и отрицательный ион. Одним из наиболее важных применений ЛОХ является разделение аминокислот, которые координируются в виде депротонированного однозарядного аниона. Остаточный заряд комплексного иона должен оставаться положительным, иначе металл будет вымываться из колонки.

Вариант, когда лиганды подвижны, а ионы металла остаются неподвижными, соответствует идеализированной модели. На самом деле ионы металла могут покидать ионообменную смолу и перемещаться вдоль колонки, поскольку они находятся в ионообменном равновесии с катионами подвижной фазы. Даже разбавленный раствор аммиака содержит ионы аммония, которые могут вытеснять ионы металла. Для того чтобы свести к минимуму этот процесс, нужно подобрать такой ионообменник, функциональные группы которого образовывали бы достаточно прочные координационные связи с ионами металла, как, например, карбоксилатные или иминодиацетатные ионы, являющиеся функциональными группами в ионообменных смолах хелекс-100 (Chelex-100):

 

 

В данном случае, однако, уменьшается способность металла связывать другие лиганды, что можно рассматривать как отрицательное явление. Необходимо также учитывать также тот факт, что некоторое количество ионов металла из ионообменника может быть вытеснено в подвижную фазу. Для сохранения постоянной концентрации ионов металла в ионообменнике в подвижную фазу обычно добавляют незначительное количество соли металла (10^-3—10^{-4 М). Координирование и обмен лигандов происходят в этом случае, как в подвижной, так и в неподвижной фазах, и тем самым создается возможность влиять на коэффициент распределения лигандов.}

Применяют таже лигандный обмен в подвижной фазе, перемещающейся по колонке. В этом случае неподвижная фаза не обязательно должна быть ионообменником, она может быть и неполярной, как, например, силикагель с привитыми октадецильными группами, являющийся самой распространенной насадкой в обращенно-фазовой хроматографии. Ионы металла добавляют в подвижную фазу, и если при этом лиганды образуют незаряженные комплексы, то последние распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Аминокислоты относятся именно к таким лигандам, и поэтому метод лигандного обмена в подвижной фазе широко используется для анализа смесей энантиомеров аминокислот, т. е. L- и D-оптических изомеров.

Отличительной особенностью ЛОХ является чувствительность этого метода к молекулярной структуре лиганда. Незначительные отличия в форме и размерах молекул подчас ведут к значительному изменению прочности их связывания металлом в ионообменнике. В трехмерной сетке ионообменной смолы заместители у донорного атома азота могут в значительной мере затруднять образование координационной связи, тогда как группы, сравнительно далеко отстоящие от донорного атома лиганда, могут взаимодействовать со смолой. Эти взаимодействия могут приводить к различным порядкам селективности. Ярче всего селективность лигандного обмена проявляется в распознавании структуры оптически активных лигандов. Наивысшим достижнием лигандообменной хроматографии явилось разделение оптических изомеров аминокислот.

Использование хирального ионообменника для этих целей впервые было предложено Даванковым и Рогожиным. Они прививали оптически активную аминокислоту L-пролин на специально подготовленный сшитый полистирол, а затем обрабатывали смолу раствором сульфата меди в водном аммиаке, в результате чего образовывался насыщенный медью полимер следующей структуры:

 

Каждый из ионов меди координируется двумя привитыми пролиновыми группами, образуя своего рода мостик. В таком виде насыщенный медью («заряженный» ионами меди) полимер способен сорбировать из водного раствора растворенные аминокислоты. При этом происходит разрушение мостика:

_______ ______ _______ ________

RPro —Cu—ProR + HA = RPro—Сu—A + HProR

где НА — растворенная аминокислота в незаряженной форме или в форме цвиттер-иона, RPro — отрицательно заряженный анион пролина, связанный с сеткой полимера (обычно линия над формулами в химии ионного обмена соответствует сорбированному состоянию или фазе ионообменника). Сорбированная аминокислота может вытесняться водой (если взаимодействие со смолой слабое) или аммиаком:

______ _________ _______ _______

RPro—Cu—A + HProR + NH₃ = RPro—Cu—ProR + NH₄⁺ A^-

Таким образом, сорбирующие системы на основе полистирола с привитым пролином, заряженным медью, можно использовать для хроматографирования аминокислот, в том числе и самого пролина.

Эти результаты послужили стимулом для дальнейших многочисленных исследований. Первоначально основное внимание уделялось синтезу и использованию хиральных (оптически активных) полимеров. С помощью таких полимеров удалось добиться высокой селективности; кроме того, они хорошо зарекомендовали себя для препаративных целей, но зоны разделяемых компонентов были широкими и процесс протекал медленно. Впоследствии были получены силикагели с привитыми оптически активными соединениями, а также обращенно-фазовые сорбенты, покрытые оптически активными аминокислотами, к которым были привиты углеводородные цепочки. Во всех случаях неподвижную фазу насыщали ионами меди. Другим, уже упоминавшимся, направлением было использование ахиральных матриц, в том числе катионообменных смол и стандартных силикагельных обращенно-фазовых сорбентов, в сочетании с элюентом, к которому добавляли хиральный расщепляющий агент. Таким путем удалось ускорить лигандный обмен и получить более узкие хроматографические зоны, однако хиральный элюент больше подходит для аналитических, чем для препаративных целей. Во всех случаях в роли хирального разделяющего агента использовали комплекс металла, чаще всего двухвалентной меди, иногда двухвалентных цинка и никеля с хиральными аминокислотами — L-пролином, L-гидроксипролином или L-фенилаланином.

Функция иона металла заключается в сближении двух молекул аминокислот при их строго фиксированной ориентации. Одна молекула (L-пролин) является оптически активным разделяющим агентом, а другая молекула представляет собой D- или L-форму расщепляемой аминокислоты. Каждая из молекул занимает определенное положение благодаря двум координационным связям с медью. Третья связь, необходимая для хирального расщепления, образуется вследствие обменных взаимодействий или стерических затруднений между боковыми углеводородными цепями двух молекул. В результате свободные энергии образования L—Сu—L и L—Сu—D диастереоизомеров могут отличаться на 2—3 кДж, что вполне достаточно для осуществления хроматографического разделения.

Таким образом, на основании приведенного материала можно сформулировать следующее определение лигандообменной хроматографии. ЛОХ — это процесс, в котором комплексообразующие соединения разделяются в результате образования и последующего разрыва лабильных координационных связей с центральным атомом металла, влияющих на их распределение между подвижной и неподвижной фазами. Разделение лигандов происходит вследствие обмена их мест у атома металла. Обмен может происходить как в неподвижной, так и в подвижной фазе.

В лигандообменной хроматографии применяются различные ионы - модификаторы, за исключением ионов щелочных металлов, которые не образуют комплексов в водных растворах, поскольку здесь происходит их полная гидратация. Чаще всего используются ионы d-элементов 4-го периода - преимущественно медь (II), образующая очень стабильные комплексы. Ряд Ирвинга – Вильямса устанавливает закономерность, согласно которой в первой переходной серии двухвалентные катионы образуют комплексы возрастающей стабильности в порядке Mn< Fe< Co< Ni< < Cu с резким максимумом у Сu, затем стабильность комплексов падает от Сu к Zn. Ион меди (II) характеризуется плоско-квадратным распределением координационных связей, что отличает его от никеля (II) с октаэдрической координацией и цинка с тетраэдрической координацией.

При выборе катиона для лигандообменной хроматографии необходимо учитывать, насколько прочно он связывается с ионообменником, являющимся неподвижной фазой. Обычно используемый в качестве ионита сульфированный полистирол удерживает медь (II) недостаточно прочно, в связи с чем она легко вытесняется ионами NH₄⁺ или другими катионами. По этой причине ионами меди (II) заряжают акриловые или хелатообразующие смолы, которые достаточно прочно удерживают эти ионы, так что они практически не вытесняются водным аммиаком.

В сочетании с сульфированным полистирольным ионитом обычно используют катионы Ni (II) или Zn (II), которые удерживаюся на неподвижной фазе более прочно, чем ионы Cu (II). Кроме того, использование ионов никеля или цинка объясняется также тем, что они образуют с многими лигандами более лабильные соединения, по сравнению с ионами меди, которые слишком сильно удерживают ряд лигандов, например 1, 2-диамины.

Преимущественному использованию цинка благоприятствует и относительно высокая скорость лигандного обмена. При проведении лигандообменной хроматографии аминокислот на сульфированном полистироле цинк дает более четкие зоны разделяемых веществ по сравнению с медью (II), что указывает на более высокую скорость лигандного обмена. Самые низкие скорости лигандного обмена наблюдались для кинетически стабильных комплексов, образованных кобальтом (III), хромом (III) и платиной (IV). Эти комплексы находят применение в лигандообменной хроматографии, но лишь в случае внешнесферного комплексообразования или ионпарной ассоциации. Кобальт (II) редко используется в лигандообменной хроматографии, поскольку в обычно используемых щелочных средах он легко окисляется кислородом воздуха до трехвалентного.

Вслед за двухзарядными катионами меди, цинка и никеля в лигандообменной хроматографии наиболее часто используют ионы кадмия (II), серебра (I) и ртути (II). Катионы кадмия находят применение в колоночной хроматографии с серусодержащими лигандами, включая тиомочевину, но основная сфера их использования — это тонкослойная хроматография, где ионы кадмия наносят на поверхность частиц силикагеля и с их помощью анализируют смеси ароматических аминов. По эффективности кадмий (II) и цинк близки между собой. Ионы серебра, введенные в состав ионообменных полимеров, а также нанесенные на поверхность силикагеля, используют при хроматографировании гетероциклических азотистых оснований и различных олефиновых соединений. Ртуть (II) обладает большим сродством к серу-содержащим лигандам, поэтому макропористый катионообменник, насыщенный ртутью (II), можно использовать для полного удаления соединений серы из нефти. Насадки с ртутью используют для хроматографирования ароматических гидроксикислот. Надо учитывать, что соли ртути (II) необратимо реагируют с ионообменными смолами на основе полистирола путем ковалентного присоединения ртути к ароматическим кольцам.

Применение в ЛОХ находит кальций, образующий комплексы с многоатомными спиртами и некоторыми сахарами. На колонках, заполненных заряженным кальцием катионообменником, обычно анализируют смеси сахаров, используя воду в качестве элюента. Хотя комплексы кальция непрочны, константы их образования в ряде случаев измерены, а механизм удерживания в основном обусловлен лигандным обменом.

Железо (III) используется для выделения и хроматографирования фенолов, ароматических кислот и гидроксикислот, b-дикетонов и даже ароматических диаминов. С помощью титана (IV) проводится разделение гидроксикислот, а с помощью алюминия— фракционирование ДНК и РНК; в качестве элюента служит щелочной глициновый буфер.

Сложность применения железа (III) и алюминия состоит в легком гидролизе этих ионов в водных растворах при рН> 3 – 4. Большой по размерам ион лантана (III) гидролизуется в меньшей степени — только приблизительно на 1% при рН=6. Смола, заряженная лантаном (III), селективно удерживает анионы карбоновых и гидроксикислот и может быть использована для их хроматографирования в ацетатном буфере в качестве элюента. В этом случае основной трудностью, характерной для лигандообменной хроматографии вообще, является низкая хроматографическая эффективность, т. е. размывание хроматографических зон, что связано с низкой скоростью лигандного обмена. Скорость ионного обмена, как правило, лимитирована скоростью, с которой ионы и молекулы могут диффундировать в ионит и из него. Обычные гелевые ионообменники, заряженные ионами трехвалентных металлов, более компактны и содержат меньше воды по сравнению с ионитами, заряженными ионами одновалентных металлов, поэтому диффузия в таких насадках протекает медленнее.

Сорбенты, используемые для удерживания катионов в лигандообменной хроматографии, могут быть органическими, неорганическими или представлять собой комбинацию органической и неорганической частей, как, например, в силикагеле с привитыми функциональными группами.

Наиболее распространенный органический катионообменник – сульфированный полистирол различной степени сшивки дивинилбензолом. Для получения необходимой жесткости степень поперечной сшивки должна достигать 8 %. В аналитической хроматографии предпочтительны частицы диаметром приблизительно 10 мкм.

Ионообменники гелевого типа благодаря своей однородности лучше подходят для аналитической хроматографии, чем макропористые смолы, так как они дают более узкие и симметричные хроматографические пики. Макропористые смолы представляют собой конгломерат из очень маленьких микросфер высокой степени сшивки; в этом случае окружение ионогенных функциональных групп неоднородно, что приводит к размыванию заднего фронта пика (образованию хвоста).

“Макросетчатые и изопористые” сорбенты представляют собой модифицированные растворителем полимеры, полученные с помощью длинных стержнеобразных молекул в качестве сшивающего агента. Такие полимеры отличаются высокой внутренней пористостью и однородностью поперечной сшивки.

При использовании в лигандообменной хроматографии сульфированных полистирольных смол гелевого типа в подвижную фазу необходимо добавлять в случае меди (II) и цинка соль соответствующего металла, чтобы предотвратить снижение содержания металла в колонке вследствие слабого удерживания этих ионов.

Ионы металлов удерживаются значительно сильнее на полимерах, содержащих другие функциональные группы. Применение находят поперечно-сшитый полистирол с привитыми фосфоновыми группами и иминодиацетатные хелатообразующие смолы, но из-за медленной диффузии хроматографическая эффективность их низка. Кроме того, обменная емкость по отношению к лигандам лимитирована координацией иона металла с функциональной группой данной смолы. Тем не менее, заряженные никелем (II) хелатирующие смолы используются для колоночной хроматографии органических кислот.

Важная область применения хелатообразующих смол, как при лигандном обмене, так и при обмене неорганических ионов, является выделение и концентрирование следов веществ из больших объемов воды. Так, например, заряженная никелем иминодиацетатная хелатообразующая смола применяется для выделения аминокислот из сточных вод; смолой, заряженной медью, извлекают аминокислоты из морской воды и мочи; для сорбции фенолов из промышленных сточных вод используют хелатообразующую смолу, заряженную железом (III).

Функциональные карбоксильные группы сшитых полиакрилат-метакрилатных смол [коммерческое название Био-рекс 70 (Bio-Rex 70)] удерживают медь (II) и другие металлы сильнее, чем сульфогруппы. Акриловые смолы алифатической структуры не образуют π -связей с разделяемыми ароматическими соединениями, что улучшает условия их разделения. Это преимущество можно наблюдать при проведении лигандообменной хроматографии амфетаминовых лекарственных препаратов: на акриловых смолах получают симметричные и сравнительно узкие пики, тогда как лигандообменники на основе полистирола дают широкие, асимметричные пики с размытым задним фронтом, что указывает на смешанный механизм удерживания. Акриловые смолы лучше зарекомендовали себя при лигандообменной хроматографии алкалоидов. По сравнению с полистирольными смолами акриловые смолы менее однородны и их свойства менее вослроизводимы.

Большим недостатком акриловых смол при использовании в условиях высокоэффективной хроматографии является их мягкость: они легко деформируются под давлением, а в закрытых колонках с ними нужно обращаться с большой осторожностью.

Еще более мягкими, чем акриловые смолы, являются сорбенты на основе натуральных полимеров — целлюлозы и декстрана. Их используют в лигандообменной хроматографии преимущественно для удерживания больших молекул биологического происхождения, например, белков и пептидов. Диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЕАЕ-целлюлоза), заряженная сурьмой, может служить также для разделения алифатических и ароматических аминов, включая диамины. Заряженный медью сефадекс G-25 (декстран, содержащий карбоксильные группы) используется для разделения аминокислот и пептидов. Декстран и сефарозу (полисахарид) обрабатывают для прививки иминодиацетатных хелатообразующих групп, насыщают медью (II), затем заполняют ими колонки и, пропуская через колонки растворы, проводят сорбцию и разделение белков и пептидов. При замене меди (II) на ртуть (II) эти насадки использовали как селективные сорбенты для белков с сульфгидрилышми группами, например папаина.

Для ВЭЖХ большими преимуществами обладают сорбенты на основе силикагеля, который благодаря своей жесткости устойчив при больших объемных скоростях элюирования и значительных перепадах давления; его легко получить с точно заданными размерами частиц и пористостью. На силикагеле с химически связанными органическими группами, в основном углеводородными цепями типа C₁₈H₃₇, проводится большое число разделений методом ВЭЖХ. Естественно, что модифицированный силикагель широко используется и в лиганднообменной хроматографии.

Одним из первых в анализе был применен силикагель с привитыми группами —CH₂CH₂CH₂­NH₂ и импрегнированный медью (II). Следующим этапом стало химическое связывание с силикагелем диаминов, полиаминов и иминодиацетатных групп для более прочного удерживания меди и других металлов. Силикагели, содержащие после обработки различными аминосиланами группы —(CH₂)₃NH(CH₂)₂NH₂, —(CH₂)₃N(CH₂COOH)₂, —(CH₂)₃N(CH₂COOH)CH₂CH₂N(CH₂COOH)₂, после насыщения медью (II) использовались в основном для разделения аминокислот и смесей алифатических карбоновых кислот. Элюирование проводилось различными буферными растворами с рН 3—6, содержащими ~ 10^{-4 М ионов меди.}

К силикагелю могут быть привиты и другие функциональные группы. Например, к силикагелю, модифицированному g-аминопропильными группами (обычная коммерческая неподвижная фаза с аминогруппами), прививали дитиокарбаматные лиганды реакцией с сероуглеродом и дикетогруппы реакцией с этилбензоилацетатом; привитые лиганды координировали медь (II).

Известны варианты анализа, когда к силикагелю через связанную с ним g-аминопропильную группу прививали винную кислоту. В синтезе использовали оптически активную D-винную кислоту, что позволяло получать асимметрическую неподвижную фазу, на которой проводили разделение оптических изомеров. На этой неподвижной фазе, заряженной медью, были разделены катехоламины и родственные соединения, включая такие аминокислоты, как диоксифенилаланин (ДОФА), а также изомеры гидроксиминдальной кислоты. В качестве элюента использовали фосфатный буфер, содержащий 3× 10^{-4 М меди (II). Оптические изомеры были разделены с хорошим разрешением за 15 мин.}

Силикагель с привитыми аминогруппами —(CH₂)₃NH₂ использовали также для проведения синтеза с 8-хинолинолом, в результате которого была получена группировка

 

Эта функциональная группа связывает железо (III) в соотношении 1: 1, в результате чего железо (III) с четырьмя координационными связями стало доступным для лигандного обмена. Полученный таким путем сорбент использовали для хроматографирования фенолов, хлор- и нитрофенолов.

Аминокислоты можно химически связывать с силикагелем различными способами. Особый интерес представляют оптически активные аминокислоты, привитые к силикагелю, поскольку такие неподвижные фазы, насыщенные медью (II), способны разделять D- и L-изомеры аминокислот, находящиеся в подвижной фазе. На силикагеле, к которому через глицидоксипропильные группы были привиты D-пролин и L-гидроксипролин, были разделены гидроксикислоты, включая миндальную и фенилмолочную кислоты.

Силикагель сам является ионообменником благодаря присутствию на его поверхности силанольных групп º Si—ОН. Он способен удерживать катионы металлов и в ряде случаев выступает в роли сорбента для лигандообменной хроматографии. Ионы металлов можно присоединить гидротермально, если, например, нагревать силикагель с насыщенным водным раствором хлорида кадмия в закрытом сосуде при 350°С в течение 2 ч. Такой сорбент применяли для хроматографического разделения ароматических и гетероциклических аминов, используя в качестве подвижной фазы смесь гексан — ацетонитрил.

Ионы меди, как и ионы других металлов, можно нанести на силикагель простым ионным обменом в водных растворах при комнатной температуре. Насадку для лигандообменной хроматографии можно приготовить, просто заполнив колонку силикагелем с размером гранул 7 мкм и затем пропустив через нее раствор сульфата меди в 1 М водном аммиаке с последующей промывкой насадки водой. Поверхностные силанольные группы обменивают свои протоны на ионы меди. После отмывки водой силикагель удерживает 0, 75 мМ меди на грамм и не содержит сульфат-ионов.

Поскольку ионы меди находятся на поверхности сорбента, т.е. диффузионный путь к ним короток, лигандный обмен проходит быстро, в результате чего получаются компактные пики (рис. 16).

 

 

Рис. 16. Хроматограмма разделения аминокислот на силикагеле, заряженном медью (II).

 

Обработанный ионами меди силикагель применяется для хроматографирования аминокислот и пептидов при элюировании раствором аммиака в смеси вода: ацетонитрил (1: 1). Особенно большое впечатление производит разделение ди- и трипептидов; этот вид хроматографии можно использовать для диагностики в медицине, т.к. возможно разделение ди-, трипептидов и аминокислот. Трипептиды выходят из колонки первыми, затем идут дипептиды, после чего вымываются аминокислоты.

Силикагель растворяется в щелочных растворах. При хроматографическом разделении на модифицированном силикагеле с водными элюентами нельзя применять элюенты с рН более 8; желательно, чтобы рН не превышало 7. Тем не менее во многих анализах используются растворы аммиака с концентрацией 0, 5 М и выше. Применение таких сильно щелочных элюентов оказалось возможным вследствие того, что силикагель, на поверхности которого адсорбирована медь, несколько менее растворим в щелочных растворах по сравнению с чистым силикагелем, и, кроме того, оксид кремния значительно хуже растворяется в органических элюентах, чем в воде.

Элюирование и обнаружение необходимо рассматривать вместе, так как это взаимосвязанные процессы. В начальный период становления лигандообменной хроматографии основное внимание уделяли разделению аминов в водном аммиаке в качестве элюента. Для ароматических аминов можно регистрировать поглощение ультрафиолетового (УФ) излучения, однако ионы металла, выходящие из колонки, также поглощают УФ-излучение, снижая чувствительность обнаружения. Алифатические амины нe поглощают в УФ-области. В этом случае можно измерять показатель преломления, который отражает любое изменение в составе элюата, но в общем случае измерение этого показателя является менее чувствительным методом, чем детектирование по поглощению УФ-излучения.

Для исследовательских целей иногда используют амины, меченные изотопами, в качестве калибровочных проб. Меткой обычно служит изотоп углерода с атомной массой 14; после разделения собирают фракции и измеряют уровень радиоактивности. В некоторых работах, посвященных исследованию лигандообменной хроматографии аминокислот, иногда используют меченные углеродом-14 аминокислоты и с помощью специально разработанного детектора измеряют радиоактивность выходящего с колонки элюата.

Обнаружение аминокислот в ионообменной хроматографии обычно проводят после их реакции с нингидрином в спиральном реакторе в течение нескольких минут при температуре 100 °С. В результате реакции образуется красный или фиолетовый раствор, поглощение которого служит объектом измерения. Нингидрин не является селективным реагентом; он взаимодействует с аминами, аминокислотами и аммиаком, и поэтому его нельзя использовать при элюировании аммиаком. Более того, следы ионов металлов также влияют на интенсивность окраски. Можно избежать этих трудностей, применив в качестве элюента пиридин вместо аммиака, поскольку нингидрин не реагирует с пиридином, и добавляя к нингидрину этилендиаминтетрауксусную кислоту для маскирования ионов меди, содержащихся в элюате.

В качестве реагента, взаимодействующего с аминами, аминокислотами и аминосахарами, но не реагирующего с аммиаком, был предложен пиридоксаль:

 

 

Соответствующая реакция протекает за 10 мин при 75 °С и приводит к образованию флуоресцирующего производного, поглощающего излучение с длиной волны 390 нм и испускающего излучение с длиной волны 470 нм. Обнаружение с помощью пиридоксаля очень чувствительно, как и большинство флуоресцентных определений. Лигандообменное хроматографирование проводят на заряженных цинком ионообменных насадках при элюировании буферным раствором ацетата натрия в уксусной кислоте с рН 4, 1—5, 1 и концентрацией цинка 10^{-3 М. Цинк не мешает определению, поэтому аммиак добавляют в элюент для ускорения элюирования сильно основных аминокислот.}

Широкое распространение в ЛОХ получил о-фталевый альдегид, при добавлении которого в элюент также образуются флуоресцирующие соединения. В присутствии сильного восстановителя это соединение легко реагирует при комнатной температуре с первичными аминами и аминокислотами, за исключением пролина и гидроксипролина, являющихся вторичными аминами. Фталевый альдегид не взаимодействует с аммиаком и показывает более высокую эффективность разделения аминокислот по сравнению с эффективностью нингидрина и флуорескамина. Проявляющая смесь состоит из 0, 8 г о-фталевого альдегида и 2 г 2-меркаптоэтанола (восстановитель) в 1 л 0, 4 М боратного буферного раствора с рН 9, 7. Аминокислоты дают различную интенсивность флуоресценции; предел обнаружения составляет несколько пикомолей. Длина волны возбуждающего излучения 340 нм, длина волны испускаемого излучения 455 нм.

Этот реагент используется также для разделения оптических изомеров аминокислот на колонке с заряженной медью катионообменной насадкой при элюировании ацетатным буферным раствором, содержащим медь (II) и D-пролин. Хиральный разделяющий агент находиnся в подвижной фазе. Для предотвращения осаждения меди при добавлении щелочного раствора о-фталевого альдегида вводится этилендиаминтетрауксусная кислота; как уже упоминалось ранее, о-фталевый альдегид не реагирует с пролином.

Кроме флуориметрического детектора при определенных условиях для детектирования аминокислот может использоваться и УФ-детектор. Аминокислоты и карбоновые кислоты обычно поглощают в области 206 - 210 нм и в элюентах с очень низким содержанием ионов меди (не более 0, 5 мг/л). Большинство УФ-детекторов, однако, снабжено ртутными источниками излучения с рабочей длиной волны 254 нм. Было замечено, что при разделении аминосахаров и аминокислот на заряженных медью ионообменных смолах с карбоксильными функциональными группами в 1 М растворе аммиака в качестве элюента в присутствии ионов меди (что является недостатком при УФ-обнаружении в более коротковолновой области < 220 нм) элюируемые зоны веществ сильно поглошают при 254 нм. Разделяемые соединения выходят из колонки в форме комплексов с медью, которые поглощают УФ-излучение сильнее и при больших длинах волн, чем комплексы меди (II) с аммиаком. Для поддержания в элюенте оптимальной концентрации ионов меди от 10^-3 до 10^{-4 М обычно перед аналитической колонки устанавливают предколонку с силикагелем, насыщенным медью. Этот способ в настоящее время является общепринятым для аминокислот и аминосахаров, а также пригоден и для обнаружения диаминов и полиаминов.}

Селективность и порядок выхода веществ в лиганднообменнойхроматографии отражают величины свободных энергий замещения лигандов в сорбенте, включающих и существенный вклад взаимодействия лигандов с матрицей носителя. Константы устойчивости комплексов металл - лиганд в водных растворах представляют лишь приблизительный ориентир. Путем замены матрицы сорбента, фиксированных ионов на его поверхности, а также противоионов металлов в элюенте можно широко варьировать последовательность элюирования.

На основании анализа порядка выхода соединений различных классов можно сформулировать следующие общие положения в отношении элюирования лигандов из системы металл - сорбент:

Во-первых, связывание лигандов очень чувствительно к стерическим затруднениям. Первичные амины, например, удерживаются сильнее вторичных аминов, а вторичные - сильнее третичных. Производные с заместителем у углеродного атома, смежного с амино-группой (например, ¾ CHR¾ NH₂), удерживается слабее, чем амины без таких заместителей.

Во-вторых, для изомеров первичных аминов, чем сильнее разветвлена углеводородная цепь, тем слабее удерживается амин лигандообменным сорбентом. Для первичных бутиламинов был выявлен следующий порядок элюирования в системе никель - сульфированный или хелатообразующий полистирол:

C C C

ç ç ç

C¾ C¾ NH₂ C¾ C¾ C¾ NH₂ C¾ C¾ C¾ NH₂ C¾ C¾ C¾ C¾ NH₂

ç

C Возрастание удерживания ¾ ¾ ®

 

Определенную роль здесь играет также взаимодействие между молекулой амина и водой подвижной фазы. Чем протяженнее молекула, тем сильнее она нарушает структуру воды, основанную на водордных связях, и тем сильнее она вытесняется из водной фазы в фазу сорбента.

В-третьих, гидроксильная группа в молекуле может усиливать или ослаблять притяжение аминов к заряженному сорбенту в зависимости от того, что оказывается сильнее - образование бидентатного хелатного кольца или усиление гидрофильных взаимодействий. Так, например, этаноламин удерживается слабее, чем этиламин на заряженном никелем сорбенте.

ЛОХ простых алифатических аминов не представлет большого практического интереса, поскольку эти соединения можно эффективно анализировать с помощью газовой хроматографии. Большую значимость имеет анализ ароматических аминов, например, при разделении амфетаминовых лекарственных препаратов. Хорошая эффективность анализа в этом случае достигается на акриловых карбоксильных смолах. При использовании меди, никеля и кадмия отмечен следующий порядок элюирования:

метамфетамин C₆H₅CH₂CH(CH₃)NHCH₃ (элюируется первым),

эфедрин C₆H₅CH(OH)CH(CH₃) NHCH₃,

амфетамин C₆H₅CH₂CH(CH₃) NH₂,

норэфедрин C₆H₅CH(OH)CH(CH₃) NH₂,

фенэтиламин C₆H₅CH₂CH₂NH₂ (элюируется последним).

Этот пример наглядно иллюстрирует влияние стерических затруднений и совместной координации гидроксильных групп.

⇐ Предыдущая891011121314151617Следующая ⇒

Поделиться:

Популярное:

1. Гидродинамическая хроматография
2. Допустимые условия микроклимата
3. Оптимальные условия микроклимата
4. Причины размывания хроматографических зон в ВЭЖХ