Гидродинамическая хроматография

Гидродинамическая хроматография (ГДХ) жидкостная хроматог­рафия, в которой роль неподвижной фазы играют стенки колонки (канала) и разделение смеси макромолекул или частиц размером от нескольких десятков нанометров до нескольких микрометров проис­ходит вследствие различия скоростей протекания подвижной фазы вдоль оси канала и у его стенок, а также за счет распределения разде­ляемых частиц по сечению канала в соответствии с их размером. Колонка заполняется твердыми непористыми сферическими части­цами из стекла, пластика или ионообменной смолы размером от 10 до 50 мкм в зависимости от эффективности колонки. Вместо колонки может применяться полый капилляр. В последнем случае говорят о капиллярном варианте ГДХ. Для целей ГДХ может быть использо­ван типовой жидкостной хроматограф. Возможно, первым исследо­вателем, наблюдавшим сегрегацию частиц в капилляре, был Пуазейль, который заметил наличие возле стенки трубки области, свободной от частиц красителя. Разработал метод ГДХ Смолл в 1974 г. К сво­ему открытию Смолл пришел в опытах, в которых он пытался рас­пространить методику эксклюзионной хроматографии на определе­ние размеров коллоидных частиц на уровне 1-2 мкм. Из-за чрезвы­чайно медленной броуновской диффузии таких частиц в жидкости их массообмен в пористой среде затруднен, что приводило к интенсив­ному размыванию пиков и низкому разрешению. Как альтернатива гелъ-хроматографического варианта по аналогии с сорбционио-десорбционным механизмом разделения компонентов на молекулярном уровне был предложен гипотетический механизм разделения коллои­дов на основе процессов флоккуляции − дефлоккуляции. Велся по­иск условий для реализации такого механизма. В опытах по разделе­нию частиц полистирольного латекса на слое катионита в потоке де-ионизованной воды при очень низком разрешении был обнаружен необычный эффект. Частицы большего размера элюировали перед частицами меньшего размера, что противоречило предполагаемому механизму флоккуляции – дефлоккуляции. Кроме того, выбранные хроматографические условия, особенно низкая ионная сила подвиж­ной фазы, вообще не шособствовалк процессу флоккуляции. Прове­денные оценки исключали возможность эксклюзии по размерам в слое катионига. Для объяснения наблюдаемых эффектов была привлече­на капиллярная модель, согласно которой свободное пространство между заполняющими колонну непористыми частицами рассматривается как система капилляров. Известно, что для вязкой жидкости, текущей в капилляре, существует параболический профиль скорости с максимумом по оси капилляра (поток Пуазейля). Коллоидная сфе­рическая частица (рис. 1.26.), введенная в цилиндрический канал, бла­годаря броуновскому движению будет совершать радиальные пере­мещения, перпендикулярные направлению потока, так что ее продоль­ная составляющая скорости соответствует локальной скорости потока. Средняя скорость коллоидной частицы поэтому будет отражать профиль скорости жидкости в капилляре за одним важным ограниче­нием. Центр частицы из-за ее конечных геометрических размеров не будет достигать прилегающих к стенкам капилляра и имеющих наи­меньшую скорость слоев. Следовательно, частица будет двигаться через капилляр со средней скоростью, превышающей среднюю ско­рость жидкости на фактор, который возрастает с увеличением отно­шения размера частицы к радиусу капилляра. Чем крупнее частица, тем большее время (по сравнению частицами меньшего размера), в процессе движения по капилляру она находится в слоях с большей скоростью несущей жидкости. Это обуславливает различие в средних скоростях переноса частиц разного размера и обеспечивает при дос­таточной длине канала их разделение. Из сказанного становится по­нятным, что более крупные частицы выходят из колонки первыми, а самые мелкие остаютсяся " в хвосте".

 

Разделение вГДХ характеризуют величиной

R_f=u_p /u_m, (1.34)

где и_p - скорость переноса коллоида, и_т - средняя скорость элюента. Последнюю оценивают по времени удерживания движущегося со средней скоростью жидкости подходящего маркера, при выборе ко­торого необходимо, чтобы он перемещался по слою лишь в свобод­ном объеме насадки и по своим свойствам мало отличался от элюен­та. Следует подчеркнуть, что обычно R_f > 1, т. е. скорость коллоидных частиц превышает среднюю скорость несущей их жидкости. Это нео­бычное явление находится в полном противоречии с общеизвестными хроматографическими закономерностями, согласно которым и только в предельном случае для несорбирующихся компонентов R_f = 1.

Рассматриваемый вариант хроматографии был назван гидро­динамическим потому, что первым его исследователям поначалу казалось, что в отличие от обычных вариантов хроматографии, в основе которых лежат определенные физико-химические взаимо­действия между сорбатом и неподвижной фазой, в этом методе силы, ответственные за разделение, определяются факторами, дей­ствующими исключительно в свободном объеме слоя насадки. Точ­нее в пространстве между зернами, доступном для гидродинами­ческого потока, без учета внутренней пористости элементов слоя. Однако последующие экспериментальные и теоретические иссле­дования показали, что гидродинамика потока - всего лишь один из факторов, определяющих R_f и механизм взаимодействия имеет гораздо более сложный характер. Например, на процесс разделе­ния влияет потенциал взаимодействия коллоидных частиц со стен­ками капилляра. Наиболее общий характер носят дисперсионные взаимодействия Лондона - Ван-дер-Ваальса и электростатические взаимодействия двойных электрических слоев. Теория гидродина­мической хроматографии проанализирована в работе.

Еще одной особенностью ГДХ является то, что хроматографируемые частицы в большинстве случаев практически нераствори­мы в подвижной фазе. Они находятся в виде суспензии, причем раз­мер частиц может быть достаточным для наблюдения за ними с по­мощью микроскопа. Это так же противоречит одному из главных правил жидкостной хроматографии, согласно которому дня успеш­ного проведения хроматографического процесса разделяемые вещества должны быть полностью растворимы в подвижной фазе.

В качестве детектора в ГДХ обычно используют турбидиметр. В зависимости от длины волны детектор работает либо по меха­низму, сочетающему рассеяние с химической абсорбцией, либо только - рассеяния света. Для коллоидов с очень малыми частица­ми (малыми по отношению к длине волны света λ ) мутность пропорциональна шестой степени диаметра частиц d, для более круп­ных частиц эта зависимость менее резкая. Как следствие сигнал от малых частиц сравнительно слабый, хотя он может быть увеличен за счет использования более коротковолнового источника. Следу­ет отметить, что при измерениях распределений частиц по разме­рам больший интерес представляет не абсолютный, а относитель­ный сигнал. Для неабсорбирующнх частиц изменения λ или отно­шения коэффициентов преломления коллоида и среды слабо влия­ют на относительные показания детектора. При абсорбции отно­сительный сигнал возрастает благодаря значительному усилению коэффициентов поглощения малых частиц. Кроме измерения мут­ности полимерной суспензии, фотометр должен давать информа­цию об оптической плотности зоны элюирования молекулярных маркеров, по которой рассчитывают среднюю скорость несущей жидкости. Оптическая плотность направляемого из колонки в де­тектор потока не должна превышать некогорого предела, чтобы обеспечить согласно закону Бера линейность зависимости оптической плотности от концентрации частиц. Зависимость поглоще­ния и рассеяния света коллоидной суспензией как от размера час­тиц, так и от их концентрации, усложняет интерпретацию резуль­татов. В раде случаев зависимостью or d пренебрегают.

Помимо турбидиметра в ГДХ, получил распространение диффе­ренциальный рефрактометрический детектор. По сравнению с турбодиметрией неабсорбирующих частиц показания дифференциаль­ного рефрактометра существенно меньше зависят от размера частиц.

При уменьшении среднего размера частиц насадки величина R_f возрастет, т. е. разрешение улучшается. Зависит R_f не только от размера разделяемых частиц и размера частиц насадки, но и от ионной силы подвижной фазы. Увеличение ионной силы во всех случаях приводит к уменьшению R_f.Это связано с электростати­ческими взаимодействиями двойных электрических слоев поверх­ности частиц насадки и коллоидных частиц. Что касается влияния скорости подвижной фазы, то с eе повышением величина R_f снача­ла уменьшается, а при достижении минимума (при рабочем давле­нии около 8 МПа) либо остается постоянной, либо возрастает.

Капиллярная гидродинамическая хроматография реализуется в ка­пиллярах в внутренним диаметром 75–800 мкм при скорости потока подвижной фазы 0.2–20 мкл/мин. Если гель-хроматография приме­нима при разделении на молекулярном уровне с М до нескольких млн. дальтон, область использования ГДХ с набивными колонками - частицы с размером 0.01–1.0 мкм, то капиллярный вариант ГДХ позволяет разделять коллоидные частицы размером 0.5–30 мкм. Для реализации капиллярной ГДХ можно применять стандартные хро­матографы, например, фирмы " Hewlett-Packard" серии HP 1100. Этот хроматограф может быть легко трансформирован в систему дтя вы­сокоэффективной капиллярной ЖХ с помощью процессора микропотока установленного перед колонкой. Стандартные исходные ско­рости потока устанавливаются равными 100 мкл/мин и при разделе­нии потока понижаются до 2–4 мкл/мин - величин скорости потока, оптимальных для капиллярных колонок с внутренним диаметром 300 мкм. Преимуществом такого подхода является то, что для вы­полнения разделений методом капиллярной ГДХ можно использо­вать стандартную хроматографическую систему.

Метод ГДХ, как и гель-хроматография, позволяет анализиро­вать полидисперсные системы. Развитие методов калибровки и чис­ленных методов расчета на компьютере позволяют получать кри­вые распределения частиц по размерам даже в случае неразделен­ных пиков. ГДХ, как экспрессный и не деструктивный метод ана­лиза частиц по размерам, позволяет исследовать кинетику процессов, в ходе которых частицы меняют свой эффективный гидроди­намический диаметр, в частности процессов усадки полимерных частиц, набухания, агрегации.

1. 4.13. Фракционирование в поперечном поле сил

Фракционирование в потоке, находящемся в поперечном физичес­ком поле (Bid-Flow Fractionation) - жидкостная хроматография, в ко­торой роль неподвижной фазы играют стенки колонки (канала) и разделение смеси макромолекул или частиц происходит вследствие различия скоростей протекания подвижной фазы вдоль оси канала и у его стенок, а также за счет распределения разделяемых частиц по сечению канала в соответствии с их размерами и поведением в при­ложенном в поперечном направлении поле (гравитационном, маг­нитном, температурном). Фракционирование в потоке под действи­ем силовых полей (FFF) методологически можно рассматривать как однофазовую жидкостную хроматографию. Силовое внешнее поле, или градиент в одной фазе, заменяет собой силы разделения и ад­сорбции и распределяет растворенное вещество между различными областями потока. Имея дело с одной фазой, можно полностью ис­ключить искажения в распределении фаз и межфазовую адсорбцию, которые неизбежно возникают во всех видах хроматографии при увеличении молекулярной массы. Разделение методом FFF приме­няют для анализа полимеров, биополимеров (белков, дипопротеи-нов, белковых агрегатов) и даже для частиц (взвесей, микроорганиз­мов, микрогелей в полимерных матрицах). В настоящее время ис­следован диапазон от 10³ до 10¹² дальтон.

Разделение происходит на основе использования внешнего поля или градиента для избирательного распределения растворенного вещества между различными областями потока в канале. Канал обычно не имеет наполнителя, имеет равномерное сечение, харак­теристики его легко рассчитываются теоретически. На рис 1.27 по­казана наиболее предпочтительная конфигурация канала.

Теоретические основы метода FFF изложены в [197]. Практичес­ки в ходе эксперимента канал работаег гак же, как колонка в про­цессе жидкостной хроматографии: насос создает ноток и управляет им, образец вводится в начало канала, детектор контролирует элюируемую жидкость. Только природа канала отличается от колонки и механизм разделения совершенно другой. В сущности, канал пред­ставляет собой хроматографичеекуго колонку, которая содержит лишь подвижную фазу. В этом способе разделения внешнее поле играет ту же роль, что и стационарная фаза. Действуя перпендику­лярно потоку, оно вытесняет растворенное вещество в относитель­но медленные области потока недалеко от одной из стенок канала.

Эти квазинеподвижные области около стенок канала играют ту же роль, что и неподвижная фаза в классической хроматографии, а поля, которые управляют ими, аналогичны силам притяжения, ко­торые создаются стационарной фазой. Теоретически разделение в поле сил имеет столько же разно­видностей, сколько их имеет хроматография. Большинство основ­ных разновидностей определяется видами " полей", которые ис­пользуются для создания удерживания в силовом поле разделения. Эти поля аналогичны видами стационарных фаз в хроматографии. В хроматографии в качестве стационарных фаз применяются жидкости, твердые поверхности, ионообменные смолы, пористые ма­териалы, жидкие кристаллы и т.д. Аналогично в качестве силовых полей можно использовать тепловые градиенты, электрические поля, поля поперечного потока, гравитационные поля.

Таким образом, ясно, что разделение в поле сил так же, как и хроматография, является универсальным методом, который может быть использован для работы с водными, неполярными и поляр­ными органическими растворителями, с молекулами произволь­ной структуры и с частицами, а также с веществами, молекулярная масса которых меняется в очень больших пределах.

 

Рис. 1.27. Форма канала с параллельными стенками для разделения в потоке под действием поперечного ноля: 1 -поток растворителя, 2 -введение образца; 3 - вектор поля, 4 - к детектору; 5 - параболический профиль потока; 6 - растворенное вещество

Теоретическая тарелка в методе FFF определяется по формуле:
H=χ ω ² ν / D, (1.35)

где ν - средняя скорость потока в канале; χ – коэффициент, связанный с длиной и шириной канала сложной зависимостью: D – коэф­фициент диффузии растворенного вещества в растворителе; ω – ширина канала.

Калибровочная зависимость для однофазовой хроматографии имеет
* V_R/V₀=ω M^q, (1.36)

где коэффициент q может принимать значения от 1/3 до 1.

Из формулы (1.36) видно, что эта зависимость позволяет согла­совать требования к широкому диапазону и хорошей разрешаю­щей способности. На рис. 1.28. приведен пример применения мето­да FFF для разделения пояистирольных полимеров, который под­тверждает возможность получения очень широкого диапазона, но отнюдь не говорит о том, что этот диапазон является максимально возможным. Ддя разделения использовали тепловое поле. Подвиж­ная фаза – вода. Разделение проводили в течение одного цикла, процесс программировался. При этом использовали канал длиной 0, 4 м и шириной 0, 02 м, образованный двумя пластинами, расстоя­ние между которыми составляло 25∙ 10^{-5 м. Одна металлическая пла­стина нагревалась, другая – охлаждалась. В качестве силового поля} служил температурный градиент, создающий тепловую диффузию. Программирование процесса заключалось в постепенном пониже­нии температуры нагреваемой пластины.

Запись кривых распределения вещества при разделении в поле сил напоминает хроматограмму из гель-хроматографии, вместе с тем особые однофазовые характеристики и иные силы, управляю­щие разделением, создают коренные отличия в способе перемеще­ния и разделения растворенных вещесгв.

 

Рис. 1.28. Разделение полистролов методом FFF. I - 4000; 2 - 20000; 3 - 51000; 4 97000; 5 - 200000; 6 - 411000; 7 860000; 8 - 1800000; 9 • 7100000 дальтон

тем особые однофазовые характеристики и иные силы, управляю­щие разделением, создают коренные отличия в способе перемеще­ния и разделения растворенных вещесгв.

Понимание этих отличий очень важно для уяснения недостат­ков и преимуществ данного способа разделения, а также для опре­деления возможности расширения диапазона молекулярных масс до очень больших величин. Поэтому уместно рассмотреть особен­ности метода FFR Площади поверхности для разделения в поле сил много меньше, чем ддя хроматографии. Причина заключается в том, что эта поверхность ограничена стенками канала. Более того, материал этой поверхности легко контролировать к заменять. Ос­новным требованием к материалу канала является способность передавать воздействие поля. Обычно этому требованию удовлет­воряет широкий круг материалов. Следующая особенность однофазовой хроматографии состоит в том, что при разделении под действием силового поля возможно довольно точное описание удерживания в этой системе, что позволяет заранее выбрать опти­мальные условия работы. Что еще более важно, можно предвари­тельно дать приблизительную оценку характеристикам сложной системы, не прибегая к снятию калибровочной кривой. Вещества в каждой точке спектра элюции можно непосредственно охаракте­ризовать с помощью некоторых физико-химических параметров, таких, как диффузия, или с помощью ряда простых физико-химических параметров. Эти параметры могут быть, в свою очередь, связаны с молекулярной массой, распределением заряда и сдруги-ми важными свойствами растворенного вещества.

Почти линейная зависимость между объемом удерживания и молекулярной массой обеспечивает достаточно широкий диапа­зон измерений по молекулярной массе при достаточно хорошем разделении. Это обстоятельство объясняется линейным возраста­нием скорости потока с ростом расстояния от стенки к центру ка­нала, а также обратной зависимостью от молекулярной массы.

Открытый и однородный канал, распределение потока в преде­лах относительно большого поперечного сечения, отсутствие ста­ционарной фазы, которая разворачивает сегменты макромолекул против потока, - все эти факторы позволяют в однофазовой хро­матографии избежать деструкции макромолекул при движении вдоль канала вплоть до очень высоких значений молекулярных масс. Простым изменением величины силового поля можно полу­чить величину объема удерживания практически в разумных пре­делах любой желаемой величины. Такой контроль является очень быстрым и может быть осуществлен, если потребуется, непосред­ственно в ходе процесса. При таком виде контроля над процессом разделения можно раздвинуть пики, слишком близко сгруппиро­ванные, улучшив тем самым их разрешение. Кроме того, путем простого снижения силы поля можно более быстро злюировать пики с очень большим временем удерживания. Другим полезным качеством такого контроля является способность полностью пре­кратить удерживание. Благодаря этому, полностью отпадает не­обходимость в такой операции, обычной в гель-хроматографии, как длительная промывка колонки с целью удаления компонентов " забивших'* колонку. В однофазовой хроматографии, если надо удалить из колонки остаток, нужно просто уменьшить воздействие силового поля до нуля и дождаться прохождения через канал объе­ма, немного большего, чем свободный объем. Силу внешнего поля в однофазовой хроматографии можно непрерывно варьировать в соответствии с любой программой. Наибольшее преимущество со­стоит в том, что программу можно использовать дтя расширения диапазона молекулярных масс. Так, если сила поля непрерывно уменьшается в течение цикла, то первыми вымываются макромо­лекулы или частицы с низкими молекулярными массами, за ними, по мере уменьшения поля, компоненты с более высокими молеку­лярными массами. Степень избирательности воздействия силово­го ноля на разделение вещества в однофазовой хроматографии пока не определена. Несомненно, что химические свойства разделяемых макромолекул или частиц будут оказывать влияние на разделение при воздействии некоторых видов полей. Важность этого эффекта требует дальнейших исследований.

По мере развития новой аналитической техники и технологии метод FFF находит все большее применение в биохимии, микроби­ологии и химии полимеров.

Одним из перспективных направлений FFF является проточное фракционирование с асимметричным электроосмотическим пото­ком. Этот метод позволяет фракционировать объекты в диапазоне от I нм до 100 мкм. Он превосходит по разрешающей способности проточное фракционирование в пуазейлевском потоке на порядок. Проточное фракционирование в асимметричном электроосмотическом потоке предложено В.П. Андреевым [201-203]. В отличие от классического проточного фракционирования в этом методе про­дольный поток – электроосмотичеекий, причем неоднородность профиля потока, необходимая для реализации метода, достигает­ся за счет изготовления стенок канала из материалов, имеющих от­личающиеся значения дзета-потенциалов. В частности, если дзета-потенциал одной из стенок канала равен нулю, то в канале будет сформирован электроосмотический поток с линейным профилем; при неравных, но имеющих один знак дзета-потенциалах стенок реализуется трапециевидный профиль, при отличии в знаках дзе­та-потенциалов стенок реализуется ситуация, когда жидкость дви­гается в одном направлении у одной из стенок и в противополож­ном направлении у другой стенки. Вариант с движением жидкости в противоположных направлениях у нижней и верхней стенок ка­нала интересен для одновременною фракционирования частично плотностям и размерам. Математическое моделирование процес­са проточного фракционирования в канале с асимметричным элек­троосмотическим потоком подтвердила высокую эффективность и разрешающую способность метода. В частности, при определен­ном сочетании возникающего в канале линейного асимметрично­го электроосмотического и пуазейлевского потоков достигается рекордная разрешающая способность, превышающая разрешаю­щую способность классического FFF на 2 порядка.

1.4.14. Электрофорез

Электрофорез электромиграционный метод разделения, смеж­ный с жидкостной хроматографией. Процесс разделения компонен­тов смеси происходит в жидком растворе электролита, т.е. жидкость является непременным и важным компонентом электрофоретической системы. Растворитель (буферный раствор) представляет собой неподвижную фазу, тогда как растворенное вещество (заряженные частицы) мигрируют под действием приложенного электрического поля. Имеются гибридные электрохроматографическис методы, в которых разделение проистекает и за счет хроматографичеекого процесса, и под влиянием внешнего электрического поля. Напри­мер, незаряженные молекулы можно разделять с помощью мицеллярной электпрокинетической хроматографии. В этом слу­чае к буферу добавляется детергент, и нейтральные молекулы рас­пределяются между буфером и мицеллами в соответствии с их гидрофобностью. Разделение в этом методе основано на подвижности мицелл, заряженных в большинстве случаев отрицательно. Посколь­ку в основе разделения лежит процесс распределения в жидкофазной среде, можно с полным основанием отнести этот метод к жид­костной хроматографии. В целом методы, в которых имеется не­подвижная фаза для ЖХ, а течение элюента и перенос пробы проис­ходит только за счет электроосмотического потока, относят к электрохроматографии. В электрохроматографии зонный электрофо­рез чаще всего сочетается с ионообменной хроматографией.

Электрофорез основан на свойстве ионизированных частиц к электрофоретической подвижности в постоянном электрическом поле. Скорость иона онределяегся в первую очередь его зарядом, размером, напряженностью поля и Умень­ше площадь сечения электрсфорегической ячейки q и электропро­водность χ . Если напряженность поля можно выразить формулой

(1.37)

то скорость идеальной сферической частицы определяется соотно­шением

(1.38)

где z – заряд частицы, Е – напряженность электрического поля, r – радиус частицы, π – вязкоегь среды.

Электрофоретическая подвижность имеет размерность см²/(В∙ с) и определяется соотношением

(1.39)

Вместе с тем приведенные выше уравнения справедливы при бесконечном разбавлении, отсутствии солей и идеальной сфери­ческой структуры частицы. В реальных условиях с повышением ионной силы снижается подвижность ионов из-за накапливания ионов противоположного знака, что приводит к снижению эффективного заряда. Безусловно, имеются отклонения в электрофоретической подвижности, связанные с не сфероидальным строением частиц. Величина и обратно пропорциональна η неподвижной фазы. Вязкость уменьшается с увеличением температуры, а под­вижность возрастает в 2.5–3 раза с повышением температуры на каждый градус. Понизить подвижность частицы можно, поместив жидкую среду в твердый носитель с волокнистой структурой или порошкообразный носитель в гель. В этих случаях путь частицы удлиняется, уменьшается напряженность поля.

Классический вид электрофореза метод подвижной границы по Тизелиусу, дает точную информацию об электрофоретической подвижносги биополимеров (белков, пептидов), но не пригоден из-за низкого разрешения для выделения чистых компонентов анали­зируемой смеси. Так, если подвижность компонентов уменьшается в раду А, В, С, А то в результате электрофореза появляется зона, обогащенная компонентом А, за ней следуют зоны смесей А+B, А+В+С, A+B+C+D, B+C+D, C+D и, наконец, зона самого медлен­ного компонента D.

При разделении методом зонного электрофореза перемещение компонентов смеси продолжается до полного их разделения. В этом методе используют неподвижный носитель, по поверхности или че­рез объем которого осуществляется миграция ионов. Носители мо­гут иметь вид полос (например, из бумаги, колонок, дисков, тон­ких слоев и др.). При проведении электромиграционных процес­сов важно, чтобы у концетрационных зон были четкие границы. Диффузию можно ограничивать при помощи градиента плотнос­ти, вращения, камер с извилистыми каналами, капиллярного эф­фекта, ламинарного потока, возрастающей вязкости, если среда жидкая. В пористой среде антиконвекционную стабилизацию зон обеспечивают применением различных типов носителей с волок­нистой структурой (разнообразные виды бумаги), гомогенных пле­нок на основе модифицированной целлюлозы, незакрепленных слоев с молекулярно-ситовыми свойствами (целлюлоза, крахмал, гранулированные гели). Кроме того, процессы проводят в различ­ных гелях (гель-электрофорез) на основе крахмала, агарозы, поли­амидов. Электрофорез реализуют под действием нолей низкого (< 1000 В) и высокого напряжения (1000–10000 В). Высоковольтный электрофорез проводят, как правило, на бумаге. Этот метод дает хорошие результаты при анализе аминокислот и других неболь­ших молекул и непригоден для анализа макромолекул. Обнаруже­ние разделенных компонентов на электрофорерограмме выполня­ют, погружая в раствор со специфичным реагентом или опрыски­вая бумагу этим реагентом.

При разделении белков и пептидов продуктивен метод изоэлектрофокусироваия. Разделение смеси проводят в среде, представ­ляющей собой смесь амфотерных соединений, образующих устой­чивый градиент рН в постоянном электрическом поле. Соедине­ния с различными изоэлектрическими точками мигрируют до та­кого положения, в котором рН равен их изоэлектрическим точ­кам. Устанавливается квазистационарное состояние, миграция со­единений прекращается, диффузия компенсируется фокусирующим влиянием электрического поля при градиенте рН. Гипотетическая смесь компонентов А, В, С и D вэтом случае расположится между низкомолекулярными амфотерными соединениями М_i: М₁А, М₂В, М₃С, М₄D, М₅. Где М_i - добавленные промежуточные фракции с различными изоэлектрическими точками.

В изотахофорезе используют два электролита - лидирующий электролит, который содержит ион с максимальной электрофоретической подвижностью, и концевой электролит, содержащий ион с минимальной подвижносгью ионов анализируемой смеси А, В, С и D). Под воздействием электрического поля смесь разделяется на примыкающие друг к другу зоны инди­видуальных компонентов, выходящих в порядке понижения их электрофоретической подвижности: лидирующий ион, А, В, С, D и кон­цевой ион. Возможность регулирования концентраций в исследуе­мых зонах за счет изменения свойств лидирующего электролита и равномерность концентрации данного компонента внутри каждой зоны делаег этот метод особенно ценным для качественного и ко­личественного анализа и препаративного разделения.

В гель-электрофорезе смесь заряженных макромолекул разделя­ется в результате различия в их заряде, размере и скорости мигра­ции через гель, помещенный в электрическое поле. При этом на электрофоретическую миграцию молекул оказывает влияние матрица геля и, поэтому достигается селективное разделение молекул по раз­мерам. Гели на основе крахмала, агарозы или силикагеля использу­ют в первую очередь для стабилизации зон. Макропористые гели, особенно гели агара и агарозы, наиболее широко применяют в ме­тоде иммуномектрофореза . Особенностью этого метода является обработка смеси белков раствором антисыворотки после проведе­ния электрофоретического разделения. Антисыворотка содержит в себе специфические антитела, воздействующие на индивидуальные компоненты смеси белков. Антигены и антитела, взаимодействуя между собой, оседают, образуя линии осаждения, каждая из кото­рых должна соответствовать определенному белку. Иммуноэлектрофорез позволяет проводить идентификацию белков серологичес­ким и физико-химическими методами. Путем введения радиоактив­ной метки в антигены можно существенно повысить чувствитель­ность метода Эта разновидность электрофореза получила название радиоиммуноэлектрофорез. Полиакриламидный гель химичес­ки весьма инертен. Его слабое сродство к красителям позволяет быстро обнаруживать биополимеры (белки, нуклеиновые кислоты) по цветным реакциям. Характерен мегод электрофореза в градиен те плотности полиакриламидного геля. На первом этапе осуществ­ляют зонный электрофорез, в заключение - молекулярно-ситовое разделение. Движение веществ от старга постепенно тормозится вследствие уменьшения пор геля. Ограничение подвижности, вызы­ваемое гелем, приводит к фокусированию зон.

1.4.15. Капиллярный электрофорез

Одним из самых современных и перспективных сепарационных методов на сегодняшний день является капиллярный электрофорез, вобравший в себя все лучшие качества хроматографических мето­дов и электрофореза. Развитие этого метода началось в конце 70-х, начале 80-х годов прошлого века с работ Миккерса, Эвериртса, Поргенсона и Лукаса. В этом методе разделение смеси заряжен­ных или нейтральных молекул основано на различии в их электрофоретичеекой подвижности и (или) распределении между раствором и движущимися в электрическом поле заряженными частицами (ми­целлами, коллоидными частицами, металлокомплексами, молеку­лами полиэлектролита). При анализе методом капиллярного элект­рофореза пробу небольшого объема (несколько нанолитров) вво­дят на анодном конце в кварцевый капилляр, заполненный ведущим электролитом (например, фосфатные и боратные буферные раство­ры с концентрациями 10-100 мМ, растворы органических и неорга­нических солей, кислот и оснований). К тонкому кварцевому капил­ляру (внутренний диаметр 25-100 мкм) длиной 20-100 см приклады­вают напряжение от 10 до 30 кВ. Под действием электрического ноля компоненты пробы начинают двигаться по капилляру с разной ско­ростью, зависящей or их структуры, заряда и молекулярной массы, и соответственно, в разное время достигают детектора. Разделение пробы достигается приложением напряжения к буферным сосудам, на электрофоретическое перемещение всегда накладывается более или менее интенсивный электроосмотический поток, способствую­щий пассивной транспортировке зоны пробы, а не ее разделению. Этот эффект сильно зависит от рН буфера и от свойств поверхности капилляра, Он может быть настолько большим, что будут двигать­ся не только нейтральные молекулы, но даже отрицательно заряжениые ионы, которые могут перемешаться к детектору, несмотря на их злектфофоретическую миграцию. На поверхности кварцевого капилляра из-за диссоциации силанольных трупп образуются в про­цессе электрофореза отрицательные заряды, вблизи стенок индуци­руются положительные заряды, и электроосмотический поток бу­дет направлен к катоду. Это обуславливает расположение детекто­ра вблизи катодного пространства. Благодаря электроосмотическо­му потоку к катоду все незаряженные молекулы перемещаются с одинаковой скоростью и не могут быть разделены, в то время как разделение заряженных ионов возможно благодаря их различной электрофоретической подвижности. Элекгроосмотический поток можно регулировать с помощью химического модифицирования по­верхности капилляра, при этом одновременно уменьшается возмож­ная адсорбция компонентов пробы на поверхности капилляра и улучшается воспроизводимость анализа. В качестве покрытий ис­пользуются алкилсилановые, фторалкильные, гидрофильные поли­эфирные, полиакриламидные и другие покрытия.

Детектирование компонентов пробы может осуществляться спек-трофотометрическим, кондуктометрическим, рефрактометрическим, спектрофлюорометрическим или масс-сиектромефическим детекто­ром. Детектор расположен ближе к катодному концу капилляра. Капилляр принудительно охлаждается. Способ ввода пробы гидродинамический (созданием давления в сосуде для пробы или созда­нием вакуума в катодном буферном резервуаре) или за счет электро­форетической миграции пробы в капилляр в результате приложения соответствующего электрического напряжения к концам капилляра. Так, в системе капиллярного электрофореза " Капель-103" ввод про­бы осуществляют гидродинамически при 900 мбар'с. На рис. 1, 29. представлена схема аппарата для капиллярного электро­фореза. Полученная электрофореграмма представляет собой после­довательность пиков, по которым, как и в хроматограмме, можно идентифицировать и количественно определить конкретное соеди­нение. Boспроизводимость времен удерживания - 5%. Среднее квадратическос отклонение выходного сигнала по высоте пика - 5 %. Пределы обнаружения веществ 0.2 - 1.0 мг/дм³. Обработка результа­тов проводится с помощью типовых хроматографических программ.

Pис. 1.29. Принципиальная схема капиллярного электрофоризера:

1 - анодная зона, вход капилляра; 2 - катодная зона, выход капилляра; 3 -де­тектор; 4 - источник высокого напряжения; 5 -регистрирую­щее устройство; 6 - контейне­ры для проб, 7, 8 - сосуды с буферным раствором

 

⇐ Предыдущая11121314151617181920Следующая ⇒

Поделиться:

Популярное:

1. Ионоэксклюзионная хроматография
2. Лиганднообменная хроматография.
3. Обращенно-фазовая хроматография
4. ФИЗИКО-ГИДРОДИНАМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУКТИВНЫХ ПЛАСТОВ
5. Хроматография на силикагеле.
6. Хроматография с динамическим модифицированием.