Тема: Массовая наработка моноклональных антител

Цель занятия: ознакомление с методами культивирования гибридом in vitro и in vivo.

Материальное обеспечение: 96- и 24-луночные планшеты для культивирования, матрасы, мыши линии Ва1В/с, суспензия гибридом, щприцы, иглы иньекционные.

После получения гибридных клеток, стабильно продуцирующих специфические антитела, можно приступить к их массовому наращиванию с целью получения больших количеств МКА. Это достигается культивированием клеток либо in vitro, либо in vivo. Гибридомы высокочувствительны к условиям культивирования in vitro. К ним относятся качество посуды, состав среды, рН, плотность культуры и т.д. Неблагоприятным фактором является как высокая, так и низкая плотность культуры. Нельзя допускать дорастания культур до высокой плотности (выше 0, 5млн/мл), при которой начинается массовая гибель клеток. Существенное значение имеет рН среды (при повышении рН деление клеток прекращается). Концентрация антител в культуральной жидкости лежит в пределах 100-250 мкг/мл.

Культивирование гибридом in vivo служит источником получения неограниченного количества МКА. При прививке сингенным мышам (линии BalB/с) гибридомные клетки образуют асцитные жидкости. Образованию асцита способствует предварительная инъекция животным минерального масла – пристана (за 7-14 сут до введения клеток по 0, 5 мл на мышь, внутрибрюшинно). Суспензию гибридом также инъецируют внутрибрюшинно по 0, 5 мл (1 млн. клеток на мышь). Опухоли образуются через 2-3 недели после прививки. Асцитную жидкость (порциями) забирают у живых мышей, вводя им в брюшную полость иглу. Для получения последней порции мышь забивают. При таком подходе от одного животного удается получить около 15 мл асцита. Концентрация моноклональных антител в асцитной жидкости (5-10 мг/мл) значительно возрастает по сравнению с культуральной средой и составляет 5-10 мг/мл.

Получение препаративных количеств моноклональных антител. Штаммы гибридных клеток культивируют в пластиковых матрасах до достижения плотности монослоя в пределах 75-80% или концентрации клеток не выше 0.5 млн/мл. Клетки культивируют 3-4 дня в СО₂ инкубаторе, а затем снимают их с поверхности пластика пипетированием и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 7 минут. Осадок клеток ресуспендируют в неполной ростовой среде и вводят 2х10⁶ клеток внутрибрюшинно мышам линии BALB/c, которым за 7-10 дней до введения гибридомы был инъецирован пристан – 2, 6, 10, 14 тетраметипентадекан (Sigma, США) в дозе 0, 5 мл на голову.

После образования асцитной опухоли через 12-14 дней мышь забивают цервикальной дислокацией. Затем тушку фиксируют на препаровальной доске и препарируют кожу вдоль белой линии живота. Асцитную жидкость собирают из брюшной полости с помощью шприца с иглой. Затем асцитную жидкость отделяют от гибридных клеток центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут. Гибридные клетки ресуспендируют в неполной ростовой среде и после подсчета количества клеток вводят в брюшную полость мышам линии BALB/c для дальнейшего накопления антител. Асцитную жидкость используют для выделения из нее иммуноглобулинов.

Литература:

1. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология) // Методы культивирования клеток, Л.; Наука.1987.с.194-205.

2. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.В. Биотехнология. Кн.3. Клеточная инженерия. Методы получения моноклональных антител. Стр.136-167.

3. Булашев А.К. Моноклональные антитела в диагностике бруцеллеза. Акмола.: Изд-во Акмолинского аграрного университета, -1995. –214с.

Контрольные вопросы: 1.Культивирование гибридом in vitro. 2.Культивирование гибридом in vivo.

Занятие №11

Тема: Криоконсервация гибридом

Цель занятия: необходимость криоконсервации гибридом и условия ее осуществления.

Материальное обеспечение: клетки гибридом, сосуд Дьюара с жидким азотом, морозильник на –70^оС, СПК, ДМСО, пластиковые ампулы для замораживания.

При продолжительном культивировании клеток in vitro существует опасность бактериального загрязнения и неконтролируемых (генетических) изменений самих клеток. Для длительного сохранения ценных клеточных линии (активно продуцирующие гибридомы) успешно применяют хранение в условиях жидкого азота (-196^оС) – криоконсервация. Замораживают клетки гибридом только в стадии активного размножения (логарифмической фазы роста). Применение криопротекторов (криозащитных агентов) позволяет снизить повреждающее действие физико-химических факторов при криоконсервировании. Наиболее широкое применение в качестве криопротектора для криоконсервации гибридом получил диметилсульфооксид (ДМСО), который обеспечивает более высокую жизнеспособность клеток и сохранение их морфофункциональ-ных свойств. Основой среды консервирования является СПК.

Успех криоконсервирования зависит от исходного морфофункционал-ьного состояния клеток и плотности замораживаемой клеточной суспензии. Гибридомы замораживают со скоростью 1-2⁰С/мин до –70⁰С (в програмном замораживателе) или при его отсутствии в пенопластовой коробке с толщи-ной стенок около 2 см в течение 2 часов с последующим погружением в жидкий азот (-196⁰С). Хранение клеток в жидком азоте в течение ряда лет не изменяет их пролиферативную активность и специфичность.

Криоконсервация гибридом. Криоконсервируют гибридомные клетки, растущие на 24–х луночных планшетах или матрасах объемом 25 см³. При отборе гибридом для замораживания выбирают ячейки с жизнеспособными клетками при плотности не менее 70-80%.

Клетки для криоконсервации готовят следующим образом: за 24 часа до криоконсервации меняют питательную среду в каждом матраце или в ячейках 24-х луночного планшета. Снимают клетки с поверхности посуды мягким пипетированием, отбирают взвесь клеток и переносят в пробирку с коническим дном. Центрифугируют 7 минут при1000 об/мин, супернатант сливают, а к осадку добавляют криопротектор. Последний представляет собой сыворотку плода коровы («Flow», Шотландия) с 10% диметилсульфоксидом (ДМСО). Осадок клеток суспендируют пипетированием и разливают в замораживающие ампулы («Nunc», Дания) в объеме 1 мл по 1-5 тыс. кл/мл. Ампулы помещают в пенопластовые коробки с толщиной стенок 2 см и ставят в низкотемпературный холодильник (Sanio, Япония)- 70°С на сутки, после чего их переносят в жидкий азот (-196°С).

Размораживание клеток в водяной бане при температуре 37-39 С является наиболее доступным и распространенным. При помощи пинцета ампулы переносят из жидкого азота в водяную баню с температурой 37 С. Ампулы объемом 1 мл размораживаются в течение 0, 5-1 мин, что зависит от материала, из которого изготовлены ампулы. Жизнеспособность клеток в суспензии зависит от скорости размораживания. Установлено, что при ее увеличении количество выживших клеток в суспензии возрастает. При нарушении герметичности ампулы могут взрываться.

Литература:

Контрольные вопросы: 1. Значение криоконсервации клеток. 2.Применение криопротектора. 3. Условия криконсервации клеток 4. Условия размораживания клеток.

Занятие №12.

Тема: Очистка моноклональных антител и определение их

Специфичности

Цель занятия: освоить методики очистки моноклональных антител, определения их константы связывания и классов иммуноглобулинов.

Моноклональные антитела можно определить как химический реагент известной структуры, который можно получить по желанию, тогда как соответствующая антисыворотка является вариабельной смесью реагентов и никогда не может быть в точности воспроизведена после гибели исходного животного. Источником получения неограниченного количества МКА служит культивирование клеток гибридом в брюшной полости сингенных мышей.

Иммуноглобулиновую фракцию из асцитной жидкости получают осаждением белков насыщенным раствором сульфата аммония с последующим диализом. Выделение чистых антител лучше всего проводить на иммуносорбентах, представляющих собой ковалентно сшитый с каким-либо носителем антиген. Обычно носителем служит сефароза. Наиболее простым методом является хроматография на сефарозе с пришитым ковалентно белком А - продуктом бактериальных клеток (Staphylococcus aureus), обладающий высоким сродством к Fc фрагменту антител.

После получения очищенных и концентрированных препаратов МКА в иммунологических реакциях определяют специфичность их действия. Проводят как качественные, так и количественные определения. Антитела гетерогенны по принадлежности к различным классам и подклассам, а также по физико-химическим и биологическим свойствам. Активность связывания антител с антигеном оценивается как аффинность, что характеризует уровень родства антител к испытуемому антигену. Высокоаффинные антитела образуют более прочные комплексы с антигеном, чем низкоаффинные. Определение константы связывания (Ксв), которая является как известно мерой аффиности, а также титров МКА в иммунологических реакциях позволяет сделать вывод о их пригодности в разработке методов обнаружения специфических антигенов или антител возбудителей инфекционных заболеваний в различных биологических жидкостях.

Класс и подкласс МКА определяют с помощью метода иммунодиффузии по Оухтерлони. Для идентификации класса антител используют набор антисывороток, специфических к отдельным классам и подклассам антител, которые производятся многими фирмами.

Специфичность МКА к детерминантам антигена-иммуногена определяют также методом иммуноблотинга, т.е. посредством перевода электрофореграммы специфических антигенов, использованных для иммунизации мышей, на нитроцеллюлозную мембрану с последующим иммунохимическим проявлением.

Антигены разделяют методом электрофореза в агарозном геле, затем гель помещают на лист нитроцеллюлозы и пропускают через него соответствующий буферный раствор в направлении от геля к нитроцеллюлозной бумаге.При этом фрагменты антигена элюируются из геля и связываются с нитроцеллюлозной мембраной, на котором в результате получается реплика геля. Такой перенос называется блоттинг (от англ.blot –промокать). После иммунохимического проявления нитроцеллюлозной мембраны выявляется четко воспроизводимый набор полос, соответствующих специфическому антигену.

⇐ Предыдущая 1 2 345 Следующая ⇒