Дифференцирование IgM и IgG антител путем использования донаторов сульфгидрила.

Когда редуцирующие агенты, такие как 2-меркаптоэтанол (2-МЕ) или дитиотрейтол (ДТТ) смешиваются с сывороткой, содержащей IgM антитела, происходит разрыв некоторых дисульфидных связей внутри молекул IgM (в частности расщепляются J - цепи). В результате обработки сыворотки 2-МЕ или ДТТ IgM антитела частично или полностью теряют свою способность вызывать агглютинацию эритроцитов, в то время как IgG агглютинины сохраняют такую способность. Таким образом, тест редукции антител сульфгидрилом является быстрым способом дифференциации IgM и IgG антител. Хотя дифференцирование не всегда является абсолютным (некоторые мономеры IgM сохраняют свою способность агглютинировать эритроциты), тесты с сульфгидрилом являются весьма полезными в практическом плане. Другими словами, агглютинины, обнаруженные в сыворотках крови беременных, могут исследоваться этими методами. Те из них, которые чувствительны к действию сульфгидрила, относятся к IgM и не способны пройти через плаценту и обусловить гемолитическое заболевание новорожденного (ГБН). Напротив, антитела, устойчивые к действию сульфгидрила и активные при 37^оС, относятся к IgG, способны пересечь плацентарный барьер и вызвать ГБН.

Если сильные моноклональные IgM антитела подвергают действию сульфгидрила, а затем удаляют путем диализа редуцирующий агент, может произойти восстановление пентамеров IgM. Чтобы предотвратить это, к сыворотке добавляют йодацетамид (ЙАА). Тем самым изменения, вызванные сульфгидрилом, становятся необратимыми. Воссоединение IgM в нормальной сыворотке обычно не создает в этом плане каких-либо проблем, поскольку оно происходит в случайной последовательности. Поэтому лишь ничтожно малое число молекул IgM антител восстанавливаются в своем первозданном виде. Таким образом, сыворотки, обработанные 2-МЕ или ДТТ в повседневной рутинной практике в дальнейшем не подвергают обработке ЙАА. Когда донаторами сульфгидрила обрабатывают иммуноглобулины класса IgA, происходит расщепление их полимеров, но не мономерных форм.

Обработка сыворотки 2-меркаптоэтанолом (2-МЕ)

1. Смешайте 1 объем неразведенной сыворотки с равным объемом 0, 2 М раствора 2-МЕ (последний получают путем смешивания 1, 49 мл 2-МЕ с 100, 0 мл изотонического раствора натрия хлорида).

2. В качестве контроля в отдельной пробирке смешайте в равных объемах испытуемую сыворотку с физиологическим раствором.

3. Инкубируйте пробы в течение 1 часа при 37^оС.

4. Необязательный этап. Проводят диализ опытной и контрольной проб в течение ночи против 1 литра изотонического раствора, забуференного до рН 7, 4.

Обработка сыворотки дитиотрейтолом (ДТТ)

1. Смешайте один объем неразведенной сыворотки с равным объемом 0, 01 М раствора ДТТ в изотоническом растворе.

2. В качестве контроля смешайте равные объемы физиологического раствора и сыворотки в отдельной пробирке.

3. Инкубируйте пробы при комнатной температуре или 37^оС в течение 1 часа.

4. Необязательный этап. Диализ против одного литра изотонического раствора, забуференного до 7, 4.

Интерпретация результатов и замечания

1. Отсутствие агглютинации сывороткой, обработанной 2-МЕ или ДТТ при сохранении агглютинационной способности сывороток из контрольных пробирок указывает на IgM природу антител.

2. Если обработанная сыворотка должна испытываться в агглютинационных тестах, проведение диализа необязательно. При необходимости ее последующего исследования в антиглобулиновом методе необходим диализ во избежание ложноположительных результатов.

3. Ложноположительные результаты возможны при контакте сыворотки, обработанной ДТТ в течение более, чем 2 часов.

4. Freedman и соавт. Нашли 2-МЕ несколько более эффективным в редуцировании агглютинирующей способности IgM антител в сравнении с ДТТ. Более высокие концентрации не могут использоваться, поскольку они вызывают образование геля в сыворотке.

5. Редукция при 37^оС оказалась несколько более эффективной, нежели при комнатной температуре.

6. 2-МЕ имеет исключительно дурной запах, ДТТ это не свойственно.

7. Дискуссию по поводу химически редуцированных IgG реагентов и их использование в качестве типирующих реагентов см. к конце этой главы.

Обработка сывороток, редуцированных 2-МЕ или ДТТ путем использования йодацетамида (ЙАА)

1. Если для редукции антител использовался 0, 2 М 2-МЕ, добавьте ЙАА до конечной концентрации 0, 2 М.

2. Если редукция проводилась путем использования 0, 01 М ДТТ, добавьте ЙАА до конечной концентрации 0, 05 М.

3. Оставьте смеси редуцированных сывороток с добавленным ЙАА на 1 час при комнатной температуре.

4. Проведите диализ смеси в течение ночи против забуференного до 7, 4 изотонического раствора натрия хлорида.

Методы сохранения небольших количеств эритроцитов в замороженном состоянии

Эритроциты в серологических тестах обычно применяются свежезаготовленными. Они могут сравнительно хорошо сохранить свои агглютинабельные свойства в течение 3 недель, если хранятся при 4^оС. Клетки можно хранить замороженными в течение длительного времени, если перед замораживанием водная их составляющая заменена на глицерин. Такая замена предотвращает образование кристаллов воды внутри эритроцитов при замораживании и их последующий гемолиз.

Наилучшим методом, обеспечивающим длительную сохранность, является замораживание и хранение в жидком азоте. Это, однако, сопровождается необходимостью приобретения и последующей эксплуатации специального дорогостоящего оборудования. Здесь не имеет смысла описывать технологию замораживания и хранения эритроцитов в жидком азоте. Тех, у кого уже имеется такое оборудование нет смысла учить на нем работать. Огромным достоинством замораживания в жидком азоте является простота метода, возможность длительного хранения (метаболизм эритроцитов сведен к минимуму), малые потери эритроцитов при оттаивании. Достаточно лишь отметить, что для оттаивания эритроциты перед использованием помещают в подогретый до 37^оС изотонический раствор, затем отмывают им 2 - 3 раза. Эритроциты, замороженные 15-20 лет назад, ведут себя в серологических реакциях как свежезаготовленные.

Замораживающий раствор для хранения эритроцитов в жидком азоте

1. Сахароза, 154 г, декстроза 59 г, хлорид натрия 2, 9 г.

2. Растворите в дистиллированной воде и доведите объем до 1 л.

3. Храните раствор при 4^оС до использования.

4. Для замораживания эритроцитов отмойте их и удалите всю плазму. Смешайте равные объемы эритроцитов и указанного замораживающего раствора.

Другие методы замораживания малых объемов эритроцитов

Предлагаются к услугам тех, у кого, к несчастью, нет возможности использовать жидкий азот. Далее описываются методы замораживания при температурах - 4, - 20 и - 40^оС.

Пропись замораживающего раствора для температур - 4^оС или - 20 ^оС

Калия цитрат трехзамещенный 1 водный 9, 70 г

NaH₂PO₄ 1, 19 г

Na₂HPO₄ 1, 40г

Растворите сухие химикалии в 300 мл дистиллированной воды, добавьте 200 мл глицерина и тщательно перемешайте.

Метод замораживания

1. Заготовьте кровь на растворе Олсвера, ACD, CPD или CPD-A1.

2. Мягко центрифугируйте кровь или оставьте на ночь для спонтанного оседания эритроцитов.

3. Удалите всю плазму и надосадочную жидкость, содержащую антикоагулянт (даже если она содержит антитела, в этом случае ее сохраняют для последующей обработки, ее техника описана далее).

4. Добавьте замораживающий раствор в объеме, равном количеству эритроцитов.

5. Осторожно перемешайте, расфасуйте пипеткой в маленькие пробирки в таких объемах, которые используются одномоментно, поскольку повторное их замораживание не допускается.

Отмывающие растворы, применяемые при размораживании

16 % раствор глицерина в 5 % растворе натрия цитрата трехзамещенного

12 % раствор глицерина в 5 % растворе натрия цитрата трехзамещенного

8 % раствор глицерина в 5 % растворе натрия цитрата трехзамещенного

4 % раствор глицерина в 5 % растворе натрия цитрата трехзамещенного

Метод оттаивания

1. Выдержите эритроциты для оттаивания при комнатной температуре.

2. Отмойте их по одному разу в каждом из растворов в убывающей концентрации глицерина.

3. Отмойте дважды в изотоническом растворе.

4. Приготовьте взвесь необходимой концентрации для последующего использования в том или ином серологическом методе.

Замечания

1. Если при отмывании отмечается выраженный гемолиз, повторите отмывание еще раз раствором той же концентрации глицерина, затем продолжайте отмывание растворами с более низким содержанием глицерина.

2. Эритроциты, хранившиеся с глицерином, иногда дают ложноположительные реакции в антиглобулиновом тесте. В этой связи необходимо выполнять контрольные тесты с соответствующими клетками, которые также хранились замороженными и подготовлены к тестам одновременно с эритроцитами требуемых фенотипов.

⇐ Предыдущая123456

Поделиться:

Популярное:

1. E) Воспитание сознательного отношения, склонности к труду как основной жизненной потребности путем включения личности в активную трудовую деятельность.
2. E) микроэкономика изучает отношения между людьми в процессе эффективного использования ограниченных ресурсов
3. I. Мир путем устрашения; вооружения и союзы
4. II. Прокомментируйте параллельные переводы и объясните необходимость использования приема конкретизации.
5. II. Прокомментируйте параллельные переводы и объясните необходимость использования приема опущения.
6. II. Прокомментируйте параллельные переводы и объясните необходимость использования приема примечаний.
7. Амортизационный фонд и порядок его использования
8. Анализ и оценка эффективности использования трудовых ресурсов.
9. Анализ использования рабочего времени и нормирования труда.
10. Анализ использования трудовых ресурсов и производительности труда
11. Анализ использования фонда заработной платы
12. Анализ наиболее эффективного использования