Тема: Отбор позитивных гибридом

Цель занятия: ознакомление с иммунологическими методами тестирования активности гибридом.

Материальное обеспечение: 96-луночный планшет для микротитрования, растворимый антиген, надосадочные жидкости гибридом, коньюгат, субстрат, считывающее устройство.

При достижении в ячейках плотности клеток 30% и более можно проводить тестирование (скрининг) гибридных клеток на продукцию специфических антител. В случае продукции гибридомой специфических антител они дают положительную реакцию со специфическим антителом. Поэтому для скрининга положительных, т.е. продуцирующих желаемые иммуноглобулины, клонов применяют различные иммунологические (серологические) реакции (иммуноферментный анализ, реакция микроагглютинации, реакция диффузной преципитации и т.д.). Они основаны на аффинности моноклональных антител к антигенным детерминантам антигена. При эквивалентных отношениях происходит образование комплекса антиген-антитело.

Скрининг гибридных клеток на образование антител является самым важным и трудоемким этапом гибридомной технологии. Метод детекции антител надо отработать до начала получения гибридом. Основные требования к методу детекции – надежность и быстрота. Проверке должно подвергаться сразу большое число проб, отобранных в стерильных условиях.

Постановка иммуноферментного анализа (Рисунок 3). Специфический антиген, использованный для иммунизации мышей, в концентрации 0, 01 мг/мл в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7, 2-7, 4, адсорбируют в ячейках планшета для иммунологических реакций («Nunc», Дания) в объеме 0, 1 мл, выдерживая в течение ночи при 4⁰С. Затем ячейки планшета отмывают три раза забуференным физиологическим раствором (ЗФР-Тв) с 0, 05% содержанием твина – 20 и готовили двукратные разведения испытуемых антителосодержащих биологических жидкостей – культуральной среды гибридом (1: 2 и выше), очищенных моноклональных антител из асцитной жидкости (1: 100 и выше) в объеме 0, 05мл.

Планшет выдерживают 1 час в термостате (37^оС). Ячейки отмывают описанным выше способом, а затем вносят антитела против иммуноглобу-

Рисунок 3 – Схема постановки

Иммуноферментного анализа

линов мыши, меченых перокси-дазой – антивидовой конъюгат («Sigma», США) и инкубируют 1 час при 37⁰С. Повторяли процедуру отмывки для удаления несвязанных продуктов реакции и в лунки вносили по 0, 1 мл раствора субстрата фермента. Субстрат готовили непосред-ственно перед использованием путем растворения 0, 01 г ортофенилендиамина (ОФД) (Sigma, США) в 10 мл 1% раствора лимонной кислоты с рН 4, 5 и добавлением 0, 005 мл 30% перекиси водорода. Положи-тельная реакция характеризуется окрашиванием раствора субстра-та в желто-коричневый цвет. В качестве отрицательного контро-ля использовали супернатант миеломной линии клеток X 63.-Ag8.6.5.3. Реакцию останавлива-

ли добавлением в лунки планшет раствора 2М серной кислоты. Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра (Dynateck, Германия) при длине волны 492 нм. Культуральная среда гибридом, оптическая плотность которой в 2 и более раза превышала значение отрицательного контроля, считалась положительной. Анализ позитивных клонов повторяется неоднократно для большей достоверности результатов.

Реакция микроагглютинации. Реакцию микроагглютинации проводили в ячейках 96-луночного планшета для иммунологических реакции с коническим дном. В лунки планшета вносили по 0, 05 мл ЗФР (рН 7, 2-7, 4) и готовили двукратные разведения испытуемых антителосодержащих биологических жидкостей – культуральной среды гибридом (1: 2 и выше), очищенных моноклональных антител из асцитной жидкости (1: 100 и выше) в объеме 0, 05мл. Затем в каждую ячейку вносили по 0, 005 мл суспензии бактериальных клеток в концентрации 1х10 кл/мл. Планшет осторожно встряхивали и выдерживали 2 часа в термостате при 37^оС, а затем 16-18 часов при 4^оС. В качестве контроля использовали культуральную среду или асцитную жидкость миеломной линии клеток. Результаты реакции учитывали визуально и определяли в крестах по следующей схеме: (++++) – полное просветление жидкости и образование агглютината на дне лунки в виде перевернутого ”зонтика”, при встряхивании “зонтик” разбивается на хлопья; (+++) – неполное просветление жидкости и хорошо выраженный “зонтик”; (++) – заметное просветление жидкости, ”зонтик” выражен умеренно; (+) –едва заметное просветление жидкости, “зонтик” выражен слабо; (-) – просветления жидкости не наступило, на дне лунки осадок в виде “пуговки”, при легком встряхивании образуется равномерная взвесь.

За титр антител принимали последнее разведение испытуемой антителосодержащей биологической жидкости, в котором произошла агглютинация не менее чем на 2 креста (++).

Литература:

1. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология) // Методы культивирования клеток, Л.; Наука.1987.с.194-205.

2. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.В. Биотехнология. Кн.3. Клеточная инженерия. Методы получения моноклональных антител. Стр.136-167.

3. Булашев А.К. Моноклональные антитела в диагностике бруцеллеза. Акмола.: Изд-во Акмолинского аграрного университета, -1995. –214с.

Контрольные вопросы: 1.На чем основаны методы тестирования гибридом. 2. Сущность иммуноферментного анализа.

Занятие №9

Тема: Клонирование гибридом

Цель занятия: необходимость этапа клонирования в гибридомной технологии, сущность метода лимитирующего разведения.

Материальное обеспечение: 96-луночные планшеты с макрофагами, 24-луночные планшеты с гибридомами, камера Горяева, пробирки для разведения суспензии клеток, автоматические дозаторы

Для получения моноклональных антител необходимо, чтобы производящие их гибридные клетки были потомками одной (единичной) клетки. Однако в большинстве ячеек могут обнаруживаться смеси клонов гибридом-продуцентов или смеси клонов гибридом-продуцентов и клонов гибридом-непродуцентов. Кроме того, для недавно образованных гибридом характерна высокая нестабильность, связанная с утратой хромосом. Эти клетки, потерявшие способность продуцировать антитела, могут перерастать антителообразующие гибридные клетки. С целью изолирования клонов гибридом, стабильно секретирующих МКА, осуществляют клонирование. Наиболее распространенным способом клонирования является метод лимитирующего разведения в жидкой фазе. Согласно распределению Пуассона, для того чтобы получить разумную вероятность только одного клона в лунке, клетки необходимо засевать при плотности 10, 1 и 0, 5 клеток на лунку. При первом клонировании активной, т.е. продуцирующей антитела, может оказаться только небольшая часть клонов. Необходимо всегда производить повторное клонирование, при котором доля положительных клонов будет возрастать.

Клонирование гибридом методом лимитирующих разведений. Ячейки 96-луночного планшета для культивирования клеток предварительно засевают перитонеальными макрофагами (1х10 кл в 0, 1 мл ростовой среды на лунку) и инкубируют 1-2 суток при 37⁰С в атмосфере с 5%СО₂. Подсчитывают концентрацию клеток в ячейках 24-луночного планшета с растущими гибридомами. Для клонирования выбираются ячейки с жизнеспособными клетками, находящимися в логарифмической фазе роста. Суспензию клеток разводят в культуральной среде до конечной концентрации 10, 1 и 0, 5 клеток в 1 мл и рассеивают на 96-луночные планшеты с питающими клетками по 0, 1 мл на ячейку. Инкубируют клетки при 37⁰С в атмосфере с 5%СО₂.Колонии растущих клеток становятся видимыми под микроскопом через 5-7 суток. Антительную активность клеток-субклонов определяют с помощью ИФА и РМА на 10 – 14-е сутки после клонирования. В течение этого периода смену среды не проводят. Для определения активности гибридом выбирают ячейки, содержащие единичные колонии клеток. Позитивные клоны, т.е. клоны гибридом-продуцентов МКА, подвергают реклонированию по описанному методу.

Литература:

Контрольные вопросы: 1. Необходимость этапа клонирования в гибридомной технологии. 2. Сущность метода лимитирующих разведении.

Занятие №10

⇐ Предыдущая 1 234 5 Следующая ⇒