Очистка моноклональных антител из асцитной жидкости методом осаждения сульфатом аммония

⇐ ПредыдущаяСтр 5 из 5

В асцитную жидкость добавляют равный объем ЗФР (рН 7, 2). К этой смеси приливают равный объем насыщенного раствора сульфата аммония (100%) и выдерживают 16-18 часов при постоянном перемешивании на шуттель-аппарате при (4⁰С). Образовавшийся преципитат собирают путем центрифугирования на холоду (4⁰С) в течение 30 минут при 5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок растворяют в ЗФР (рН 7, 2) в объеме исходной асцитной жидкости. Полученный раствор диализовывают 1 сутки против ЗФР и определяли концентрацию белка.

Очищенные моноклональные антитела хранили при 70⁰С без консерванта или при 4⁰С с добавлением 0, 1% азида натрия.

Определение концентрации моноклональных антител в асцитной жидкостиВ лунки 96-луночного для микротитрования вносят по 0, 05 мл ЗФР (рН 7, 2-7, 4) и готовят двукратные разведения очищенных МКА из асцитной жидкости (1: 2 и выше) в объеме 0, 05 мл. В качестве контроля раститровывают бычий сывороточный альбумин (БСА) с исходной концентрацией 1 мг/мл. Затем в каждую лунку вносят по 0, 05 мл реактива Бредфорда и учитывают результат на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Определение константы связывания моноклональных антителКонстанту связывания моноклональных антител определяют по методу J. Beatty et. al. Для этого в три ряда 96-луночного планшета для иммунологических реакции сенсибилизируют специфическим антигеном, использованным для иммунизации, в оптимальной концентрации 10 мкг/мл и три ряда этим же антигеном, но в концентрации вдвое ниже оптимальной – 5 мкг/мл в ЗФР (рН 7, 2-7, 4) при 4⁰С в течение ночи. Планшет отмывают по три раза ЗФР и ЗФР-Тв и раститровывают на три ряда МКА из очищенной асцитной жидкости, начиная с концентрации 5мкг/мл. После инкубации (1, 5 ч при37⁰С) и отмывки, в лунки планшета вносят антивидовые антитела, меченные пероксидазой хрена, в рабочем разведении. Концентрацию связавшихся антител определяют спектрофотометрически, реакцию проводят в объеме 0, 05 мл.

После получения результатов ТИФА строят кривые зависимости связывания различных разведений моноклональных антител с оптимальной концентрацией антигена. Константу связывания определяют по формуле:

где (МКА)-концентрация антител, соответствующая 50% связыванию от максимального при оптимальной концентрации антигена, соответствующая 50% связыванию от максимального при вдвое меньшей концентрации антигена.

Определение класса и подкласса моноклональных антителКласс и подкласс моноклональных антител определяют с помощью двойной иммунодиффузии по методу O. Ouchterlony. На поверхность обезжиренных предметных стекол, расположенных на строго горизонтальной поверхности, заливают расплавленный 1%-ный агар (Difco, США) до образования слоя толщиной 1, 5 мм. После застывания агара с помощью специального трафарета и пробойника вырезают лунки диаметром 2-3 мм. В центральную лунку вносят 0, 05 мл исследуемых МКА, а в остальные – по 0, 05 мл специфических антител против классов и подклассов иммуноглобулинов мыши (Sigma, США). Чашки с предметными стеклами инкубируют во влажной камере не менее суток при комнатной температуре.

Результаты реакции учитывают по наличию полос преципитации между лунками с испытуемыми МКА и моноспецифическими антисыворотками. Для контрастирования полос преципитации препарат окрашивают раствором Кумасси G-250 (см.приложение) в течение 10-15 минут. После окрашивания геля проводят обесцвечивание фона с помощью раствора для обесцвечивания (см. приложение).

Постановка иммуноблотингаПостановка иммуноблотинга предусматривает следующие этапы: 1) проведение электрофореза, 2) перенос электрофореграммы на нитроцелллюлозную мембрану и 3) иммунохимическое проявление нитроцеллюлозных реплик. Электрофорез специфических антигенов, использованных для иммунизации мышей линии BalB/с, проводят в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) по методу J. Laemmli (1970) на аппарате для вертикального электрофореза (Hoefer Scientific, США). Тщательно промытые и обезжиренные стеклянные пластины (12х15см) монтироуют с помощью прокладок и зажимов. Для предотвращения утечки растворов прокладки смазывают вазелином. Заливали пространство между пластинами раствором для разделяющего геля (см. приложение). После полимеризации нижнего геля вставляют гребенку и заливают оставшееся пространство раствором для концентрирующего геля (см. приложение). Испытуемые образцы разводят в соответствующем буфере (см. приложение) в соотношении 1: 1, кипятят на водяной бане в течение 3-5 минут и охлаждают. Электрофорез проводят при силе тока 20мА и конечном напряжении 220в. По завершении процесса гель вынимают из пластин, окрашивают в течение 1 часа и отмывают в нескольких сменах обесцвечивающего раствора до полного исчезновения фоновой окраски.

Электрофоретический перенос антигенов из геля на нитроцеллюлозную мембрану осуществляют с помощью прибора для иммуноблотинга (Hoefer Scientific, США). Прибор готовят к работе следующим образом: на графитовую пластину помещали фильтровальную бумагу (Whatman США) смоченную в анодном буфере №1 (см. приложение ), затем – смоченную в анодном буфере №2 (см. приложение), накрывают нитроцеллюлозной мембраной (Millipore, США) и укладывали на мембрану полиакриламидный гель, накрывают его фильтровальной бумагой, смоченной в катодном буфере (см. приложение) и закрывают прибор. Электрофоретический перенос проводят при постоянной силе тока 0, 8 мА/см² геля в течение одного часа. Для иммунохимического проявления специфических антигенов нитроцеллюлозную мембрану сначала инкубируют в1% растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение ночи при 4⁰С. Затем отмывают по три раза ЗФР и ЗФР-Тв и выдерживают 1, 5 ч при 37⁰С в растворе моноклональных антител из очищенной асцитной жидкости, разведенной 1: 100 в ЗВР-Тв. После чего носитель вновь отмывают и инкубируют в рабочем разведении антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена (1 ч при 37⁰С). Повторяют процедуру отмывки и проявляют реакцию по расщеплению субстрата. Раствор субстрата готовят непосредственно перед использованием следующим образом: 0, 01 г 4-хлор-1-нафтола (Sigma, США) растворяют в 2 мл метанола, смешивают с 18 мл ЗФР (рН 7, 2-7, 4) и добавляют 0, 01 мл 30% перекиси водорода.

Литература:

1. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология) // Методы культивирования клеток, Л.; Наука.1987.с.194-205.

2. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.В. Биотехнология. Кн.3. Клеточная инженерия. Методы получения моноклональных антител. Стр.136-167.

3. Булашев А.К. Моноклональные антитела в диагностике бруцеллеза. Акмола.: Изд-во Акмолинского аграрного университета, -1995. –214с.

Контрольные вопросы: 1. Определение белка по методу Брэдфорда. 2.Определение константы связывания моноклональных антител. 3. Определение классов и подклассов моноклональных антител.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Забуференный физиологический раствор (ЗФР) –готовят путем растворения 8, 775 г натрия хлористого и 3, 58 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного в 1000 см³ дистиллированной воды, рН доводят до 7, 2-7, 4 с помощью натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного.

Забуференный физиологический раствор с твином (ЗФР-Тв) –готовят добавлением 0, 5 см³ твина–20 в 1000 см³ забуференного физиологического раствора

45% раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) -ПЭГ-4000 («Serva», ФРГ) расплавляют на водяной бане до жидкого состояния. Затем к 1, 5 мл неполной культуральной среды RPMI – 1640 добавляют 1, 5 мл расплавленного ПЭГ-4000 и 0, 3 мл диметилсульфоксида (Sigma, США). Пробирку оставляют открытой на воздухе до тех пор, пока рН раствора не станет щелочным (8, 0 – 8, 5). Приготовленный раствор ПЭГ стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0, 22 мкм.и держат до применения в термостате при 37⁰С

Разделяющий гель для электрофореза: 12, 5 мл 30% акриламида; 7, 5 мл 1, 5М трис-НСl (рН8, 7); 6, 5 мл дистиллированной воды; 0, 03 мл10% ДСН; 0, 001 мл ТЕМЕД и 0, 01 мл 10% персульфата аммония

Концентрирующий гель для электрофореза: 1 мл 30% акриламида, 1 мл 1%бисакриламида; 2, 5 мл 0, 5М трис-НС1 (рН 6, 8); 5, 35 мл дистиллированной воды; 0, 01мл 10 % ДСН; 0, 005 мл ТЕМЕД и 0, 05 мл 10% персульфата аммония.

Буфер для разведения образцов: к 0, 315 мл 1М трис-НС1 (рН 6, 8) добавляют 0, 25 мл 2-меркаптоэтанола; 0, 5 мл глицерина, 0, 115 мл 10% ДСН; 0, 05 мл 0, 1% бромфенолового синего и доводят объем до 5 мл дистиллированной водой

Катодный буфер для иммуноблотинга: 0, 3 гр. трис и 0, 5гр.аминогенной кислоты растворяют в 20 мл метанола и доводят объем до 100 мл дистиллированной водой

Анодный буфер №1для иммуноблотинга: 3, 6 гр. трис растворяют в 20 мл метанола и доводят объем до 100 мл дистиллированной водой;

Анодный буфер №2 для иммуноблотинга: 0, 3 гр трис растворяют в 20 мл метанола и доводят объем до 100мл дистиллированной водой.

Раствор красителя: 5 г Кумасси G-250 растворяют в 1000 мл растворителя, состоящего из 450 мл дистилированной воды, 450 мл этанола и 100 мл ледяной уксусной кислоты.

Раствор для обесцвечивания: смешивают метиловый спирт, уксусную кислоту и дистиллированную воду в соотношении 50: 10: 40 соответственно.

Реактив Бредфорда: 100 мг Кумасси G-250 растворяют в 50 мл этанола, добавляют 100 мл 85% Н₃РО₄, после охлаждения доводят объем до 1 литра дистиллированной водой

Насыщеннный раствор сульфата аммония: растворяют в дистиллированной воде сульфат аммония при постоянном перемешивании до получения нерастворимого осадка.

2-кратные растворы селективных сред ГАТ или ГТ: 2 мл 50-кратного концентрата ГАТ или ГТ («Serva», ФРГ) добавляют к 48 мл полной ростовой среды (концентраты ГАТ или ГТ хранят при -20⁰С)

⇐ Предыдущая 1 2 3 45