|
Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
|
|
Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
Кафедра ветеринарной микробиологии и биотехнологииСтр 1 из 5Следующая ⇒
Кафедра ветеринарной микробиологии и биотехнологии МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ для проведения лабораторно – практических занятий по дисциплине «КЛЕТОЧНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ» АСТАНА, 2005
Методические рекомендации для проведения лабораторно – практических занятий по дисциплине «Клеточная биотехнология» для студентов высших учебных заведений по специальности 050701 – биотехнология. Казахский государственный агротехнический университет им. С. Сейфуллина. Астана, 2005 г. ___стр.
Целью методических рекомендации является ознакомление студентов с основами клеточной технологии – получением моноклинальных антител с помощью гибридомной технологии. Студенты ознакомятся с необходимым оборудованием, компонентами питательных сред, с методами отбора и иммунизации экспериментальных животных, подготовкой миеломных клеток и макрофагов, техникой гибридизации, селекции, клонирования, замораживания гибридом, а также с иммунологическими методами тестирования.
Рассмотрено и рекомендовано на заседании кафедры ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Протокол №__, от «___»__________ 2005 г.
Рассмотрено и рекомендовано на заседании методической комиссии факультета ветеринарной медицины. Протокол №__, от «___»_______ 2005 г.
© Казахский государственный агротехнический университет им. С. Сейфуллина
С О Д Е Р Ж А Н И Е
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
МКА –моноклональные антитела ИФА- иммуноферментный анализ ГАТ- гипоксантин, аминоптерин и тимидин ДМСО – диметилсульфооксид ПЭГ- полиэтиленгликоль СПК – сыворотка плода коровы ГГФРТ- гипоксантинфосфорибозилтрансфераза ТК- тимидинкиназа РМА- реакция микроагглютинации ЗФР – забуференный физиологический раствор ЗФР-Тв – забуференный физиологический раствор с твином-20 ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота
ВВЕДЕНИЕ
Антисыворотки – основной инструмент исследований в классической иммунологии – содержат большой набор отличающихся друг от друга антител. Это связано не только с «поливалентностью» иммунизирующего материала, но и с клонированностью клеток иммунной системы организма. Каждый лимфоидный клон иммунной системы вырабатывает особый вариант специфического антитела, что обуславливает их высокую гетерогенность в сыворотке крови иммунизированного животного. Спектр вырабатываемых антител изменяется как в ходе иммунного ответа, так при использовании различных животных. Следует отметить также сложность приготовления антигенов, необходимых для получения специфических антисывороток, трудоемкость и дороговизну содержания лабораторных животных и т.д. Серьезную проблему представляет неспецифическое связывание и перекрестная реактивность поликлональных антител при их использовании в различных иммунологических реакциях. В иммунологии уже давно возникла идея создания моноспецифичных гомогенных антител, однако данные опыты имели чисто теоретическое значение. Предпосылками для возникновения гибридомной технологии были разработки двух методических подходов: 1) получение миелом (линии опухолевых клеток лимфоидного происхождения) и адаптация их к условиям культивирования вне организма и 2) метод соматической гибридизации клеток. Успешное выделение гибридов соматических клеток стало возможным благодаря использованию селективных сред и агентов, способствующих слиянию (вирус Сендай, полиэтиленгликоль и т.д.). В 1975 г Г. Келер и К. Мильстейн разработали методику получения клеточных гибридов – гибридом от слияния нормальных лимфоцитов иммунизированных животных с культивируемыми в питательной среде клетками миеломных штаммов. Слившиеся клетки наследовали от лимфоцита – способность к биосинтезу специфических антител, а от другого партнера (опухолевых клеток) - способность у неограниченному росту in vitro. Полученный гибридный клон (гибридому) можно размножить, а синтезируемые им моноклональные антитела (МКА) получать в неограниченном количестве, причем молекулы антител против индивидуальных эпитопов антигена будут биохимически и иммунологически идентичны между собой. Гомогенность, воспроизводимость и стабильность МКА представляет интерес в исследованиях, где требуется индикация биоорганических соединений, несущих на себе признаки генетически чужеродной информации. МКА являются новым поколением иммунодиагностических и иммунотерапевтических препаратов. В настоящее время МКА находят широкое применение в медицине и ветеринарии как реагенты для определения возбудителей инфекционных заболеваний и специфических к ним антител, для типирования клеток крови, идентификации онкогенов. МКА также использованы при изучении структуры антигенов, а также в качестве средств иммунопрофилактики. Занятие № 1. Лабораторной посуды
Цель занятия: ознакомление с сущностью и основными этапами гибридомной технологии, организацией работы и необходимым оборудованием (приборы и их назначение, виды пластиковой посуды и т.д.). Материальное обеспечение: ламинарный бокс, СО2-инкубатор, низкоскоростная центрифуга, инвертированный микроскоп, водяная баня, холодильник, морозильник (-700С), сосуд Дьюара, аппарат Милли-Q, пластиковая посуда, схема этапов гибридомной технологии. Сущность гибридомной технологии заключается в получении гибридом – клонов гибридных клеток – от слияния (гибридизации) нормальных лимфоцитов иммунизированных мышей и миеломных (опухолевых) клеток. Эти гибридные клетки способны с одной стороны, к синтезу специфических антител, а с другой – к неограниченному росту в процессе культивирования. Гибридомная технология позволяет получать моноклональные антитела, т.е. антитела, продуцируемые потомками одной клетки. Моноклональные антитела высокоспецифичны, т.к. направлены против одной антигенной детерминанты антигена, использованного для иммунизации мышей (Рис 1).
Рисунок 1 – Схема получения Моноклинальных антител Процедура получения моно-клональных антител (МКА) включает следующие этапы: 1) иммунизация; 2) слияние нормальных лим-фоцитов от иммунизированных мыщей с клетками миеломы и селекция гибридом; 3) скрининг (тестирование) гибридом на продукцию специфичных МКА; 4) получение стабильных линий -продуцентов (клонирование); 5) характеристика МКА; 6) массовая наработка МКА – культивирование in vivo и in vitro; 7) очистка МКА; 8) криоконсервация гибридом.
Спецификация необходимого оборудования: 1.Ламинарный бокс («Assab” Швеция) - c вертикальной или горизонтальной подачей стерильного воздуха. Стерильность обеспечивается наличием фильтров, задерживающих частицы крупнее 0, 3 мкм. 2. СО2- инкубатор («Heraeus” ФРГ ) - для культивирования гибридом, в котором автоматически поддерживается высокая (до 98%) относительная влажность, необходимая температура (37оС) и заданная концентрация СО2 - 5%. Обеспечивает поддержание необходимой величины рН в питательной среде и ее минимальное испарение в период инкубации клеток. 3. Низкоскоростная центрифуга (“Labimeks”, Польша) - для осаждения клеток (желательно с охлаждением). 4. Инвертированный микроскоп («Opton” ФРГ) – для наблюдения клеток в культуре, т.е.в процессе их роста in vitro (в культуральной посуде). Принцип инвертированности (перевернутости) заключается в том, что в подобных микроскопах объект наблюдения освещается сверху и наблюдается через объективы, расположенные под объектом. 5. Холодильники (на + 40 и на –200С) - для хранения питательных сред и реактивов. 6. Водяная баня (на 37 и 560 С)- для размораживания гибридом. 7. Низкотемпературные холодильники («Sanio”, Япония) на –700С – для криоконсервации клеток 8. Сосуд Дьюара с жидким азотом - для криоконсервации клеток. 9. Дистиллятор 10. Установка для получения сверхчистой (бидистиллированной) воды Milli-Q (“Millipore” США) 11. рН-метр 12. Фильтродержатели для мембранных фильтров (“Millipore” США). 13. Шуттель-аппарат 14. Мешалка магнитная 15. Спектрофотометр (“Dunatech» ФРГ) - для учета результатов иммуноферментного анализа Занятие № 3 Тема: Иммунизация
Цель занятия: определение вида экспериментального животного, назначение процесса иммунизации и его зависимость от природы антигена, проведение иммунизации и определение ее эффективности. Материальное обеспечение: беспородные мыши, мыши линии Ва1В/с, иммунизируемый антиген, шприцы для инъекции, полный адъювант Фрейнда.
Выбор экспериментального животного для иммунизации определяется наличием родительских миеломных линий, возможностью получения гибридных клеток этих линий и иммунных лимфоцитов, а также способностью к размножению полученных гибридом в организме данного вида животного. Обычно для иммунизации используют линии мышей и крыс, сингенных в отношении миеломных клеток. Подходящие миеломные клетки мышей и крыс широко распространены, и кроме того, не представляет сложностей выращивание полученных гибридом в организме этих животных. При иммунизации мышей широко используют линию BalB/с. Для получения антителопродуцирующих гибридом используются лимфоидные клетки (лимфоциты), выделенные из различных источников, например из селезенки или лимфатических узлов. Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы увеличить долю лимфоидных клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности, и перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они способны сливаться и образовывать антителообразующие гибридные клетки. Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимо выделять клетки животных через 3-4 сутки после последнего введения антигена, т.е. тогда когда в лимфоидных органах много активно пролиферирующих клеток. Конкретная схема иммунизации зависит от природы антигена и его иммуногенности. Антигены клеточной поверхности (цельные клетки) являются сильными иммуногенами, тогда как большинство растворимых антигенов (белки, полисахариды и т.д.) – слабые иммуногены. В последнем случае необходимо применять различные адъюванты, усиливающие иммунный ответ (полный или неполный адъювант Фрейнда – ПАФ или НАФ). Обычно антиген вводят неоднократно, что необходимо для развития сильного иммунного ответа. По ходу иммунизации необходимо определять титр антител к антигену (титр антител – величина, обратная разведению сыворотки, при которой степень иммунологической реакции снижается в два раза по сравнению с максимальной). Обычно это делают перед последней иммунизацией. В опыт отбирают животных с высоким титром антител. Не следует ожидать хороших результатов гибридизации, если при иммунизации животных отсутствует образование антител или они образуются в низком титре. Для иммунизации используют мышей 8- недельного возраста линии BALB/с (Таблица 1). Таблица 1 – Схема иммунизации мышей линии BALB/c (по И.И.Фридлянской, 1988)
Мышам в первый день иммунизации вводят внутрибрюшинно по 100 мкг антигена в 0, 1 мл неполного адъюванта Фрейнда (Gibco, США). На 7, 11, 12, 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг антигена в забуференном физиологическом растворе, рН 7, 2-7, 4. Спустя три дня после последней иммунизации извлекают селезенки с тех мышей, которые имеют более высокие титры в иммуноферментном анализе(ИФА). Литература : 1. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология) // Методы культивирования клеток, Л.; Наука.1987.с.194-205. 2. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.В. Биотехнология. Кн.3. Клеточная инженерия. Методы получения моноклональных антител. Стр.136-167. 3. Булашев А.К. Моноклональные антитела в диагностике бруцеллеза. Акмола.: Изд-во Акмолинского аграрного университета, -1995. –214с. Контрольные вопросы: 1.Чем определяется выбор экспериментального животного. 2. Назначение процесса иммунизации. 3. Иммуногенность антигенов. 4.Титры иммунизации и их значение.
Занятие №4 Тема: Подготовка миеломных клеток к гибридизации.
Цель занятия: значение миеломных клеток в гибридизации, их источники и условия культивирования. Материальное обеспечение: ламинарный бокс, СО2-инкубатор, культуральная среда, сосуд Дьюара, низкоскоростная центрифуга, пластиковая ампула с замороженными миеломными клетками, водяная баня, 24-луночные планшеты для культивирования.
Одной из предпосылок возникновения метода гибридомной технологии является разработка методики получения и культивирования миелом - злокачественных опухолей костного мозга. Миеломы индуцируют у животных путем внутрибрюшинного введения минеральных масел или инертного твердого пластика. Миеломные клетки (линии опухолевых клеток лимфоидного происхождения) представляют собой один клон клеток-антителопродуцентов, т.е являются потомками одной клетки. Они продуцируют аномальные иммуноглобулины (с неизвестной специфичностью), но сходные по структуре и обладают способностью бесконечно культивироваться in vitro. Экспериментаторам удалось получить миеломы только у двух линии мышей - BalB/с и NZB. Миеломные клетки мышей оказались чрезвычайно удобными для изучения биохимии продукции иммуноглобулинов. В результате успешных опытов по получению гибридных клеток, образующихся при слиянии (гибридизации) двух миелом, оказалось, что в полученных гибридах синтезировались иммуноглобулины обеих родительских миеломных линии. Впоследствии исследователям удалось выделить линии миеломных клеток мышей, в которых отсутствовала экспрессия (образование) цепей иммуноглобулинов – Sp2/0 Ag14 и X63Ag8 6.5.3. Преимуществом этих клеток является утрата ими способности синтезировать собственные иммуноглобулины. В качестве партнеров для гибридизации используют генетически маркированные (мутантные) клетки или линии миеломных клеток дефектные по некоторым ферментам, участвующим в синтезе нуклеотидов ГГФРТ или ТК ( ГГФРТ -гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза или ТК- тимидинкиназа). Мутантные по ферменту ТК линии миеломных клеток резистентны к токсическому аналогу тимидина – 5-бромдезоксиуридину, по ферменту ГГФРТ – резистентны к токсическому аналогу гуанина – 8-азагуанину. Эти токсические аналоги настолько сходны с нормальными пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, что поглощаются клеткой и включаются в биосинтез ДНК. Вприсутствии токсических аналогов выживают только те миеломные клетки, в которых отсутствует фермент, способствующий включению этого аналога в ДНК. Такие генетически маркированные линии миеломных клеток в дальнейшем не способны к выживанию на селективной среде ГАТ, что позволяет осуществить селекцию гибридом (Рисунок 2).
Рисунок 2–Принципы селекции и отбора мутантных миеломных клеток
Для исключения реверсии (хромосомных мутации) миеломные клетки целесообразно каждые 6 мес культивировать на среде RPMI-1640 в присутствии токсического аналога. Миеломные клетки растут частично в виде монослоя, частично в виде суспензии. Плотность культивирования для этих клеток – 1, 0-1, 5 х106 кл/мл. Таблица 2 - Характеристика основных миеломных линий мышей, используемых в гибридомной технологии
Подготовка миеломных клеток к гибридизации. Для гибридизации используют миеломную линию клеток Х 63 Ag 8.6.5.3 (резистентную к 8-азагуанину). Если используемая линия клеток обладает хорошей способностью образовывать гибридомы, необходимо размножить их и заморозить достаточное количество ампул в жидком азоте. Замороженные пластиковые ампулы с миеломными клетками из сосудов Дьюара с жидким азотом переносят в водяную баню (37оС) до полного растворения льда, Ампулы размораживаются в течение 0, 5-1 мин, что зависит от материала, из которого изготовлены ампулы. Жизнеспособность клеток в суспензии зависит от скорости размораживания. Установлено, что при ее увеличении количество выживших клеток в суспензии возрастает. При нарушении герметичности ампулы могут взрываться. Содержимое ампулы переносят в центрифужную пробирку с 10 мл холодной неполной ростовой среды и перемешивают, затем центрифугируют 5-7 минут при 1000 об/мин. Супернатант (надосадочную жидкость) сливают, затем к осадку клеток добавляют необходимый объем полной ростовой среды, суспендируют и переносят в ячейки 24-х луночного планшета на слой «питающих клеток». Инкубируют клетки при 37оС в атмосфере с 5% СО2. Рост клеток ведут до достижения плотности монослоя в пределах 75-80% или концентрации клеток не выше 0, 5х106 млн/см. Затем легким суспендированием ростовой среды снимают клетки и взвесь переносят пластиковые матрасы. Объем суспензии в матрасе увеличивают в 3-5 раза путем добавления полной ростовой среды. Для гибридизации используют клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста. Литература : 1. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология) // Методы культивирования клеток, Л.; Наука.1987.с.194-205. 2. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.В. Биотехнология. Кн.3. Клеточная инженерия. Методы получения моноклональных антител. Стр.136-167. 3. Булашев А.К. Моноклональные антитела в диагностике бруцеллеза. Акмола.: Изд-во Акмолинского аграрного университета, -1995. –214с. Контрольные вопросы: 1.Миеломы и их свойства.2. Линии миеломных клеток и их преимущества. 3. Условия культивирования миеломных клеток. Занятие №5 Тема: Подготовка «питающего слоя» (выделение макрофагов) Цель занятия: значение «питающего слоя» при культивировании гибридом и освоение методики выделения макрофагов. Материальное обеспечение: беспородные мыши, стерилизатор, щприцы объемом 10 мл, иглы инъекционные, пинцеты, ножницы, препаровальная подставка, пластиковая посуда.
Техника получения гибридом в сущности представляет собой получение клеточного потомства из одной клетки, посеянной при очень низкой плотности (1-4 клетки на 0, 2 мл среды). Известно, что при низкой плотности рост клеток сильно замедляется и в значительной степени определяется наличием в среде в достаточном количестве различных питательных и стимулирующих факторов. Размножение медленно растущих гибридных клеток можно стимулировать добавлением неразмножающихся клеток питающего слоя («feeder cells»), которые снабжают культуру различными ростстимулирующими факторами. Чаще всего в качестве клеток питающего слоя используют перитонеальные клетки (макрофаги). Макрофаги выполняют еще одну важную функцию: они фагоцитируют погибающие в ходе селекции неслившиеся миеломные клетки. Последние при гибели выделяют в среду токсины, ингибирующие рост гибридных клеток. Перитонеальные клетки получают от беспородных мышей (сингенность мышей не является обязательным требованием при выборе донора «питающих» клеток). Плотность культивирования для этих клеток - 0, 5-1 млн. клеток в 1 мл, т.к при большей концентрации активированные макрофаги могут уничтожать гибридомные клетки. Приготовление «питающего слоя» из перитонеальных макрофагов. За 2-3 дня до слияния клеток, в стерильных условиях выделяют пери-тонеальные макрофаги от беспородных мышей и высевают их в ячейки 96-луночных планшет для культивирования. Мышь забивают путем цервикаль-ной дислокации, кожные покровы обрабатывают спиртом и закрепляют на препаровальной подставке. Пинцетом растягивают конечности и фиксируют их. Производят продольный разрез кожи по белой линии живота, а также верхние и нижние разрезы. Растягивая кожу в противоположных направле-ниях, обнажают брюшную полость. Шприцем вводят в брюшную полость 10 мл неполной культуральной среды и в течение 5 минут производят раздраже-ние брюшины путем легкого постукивания пинцетом. Затем отсасывают суспензию перитонеальных макрофагов из брюшной полости и осаждают их центрифугированием при 1000 об/ мин в течение 10 минут. Осадок клеток ресуспендируют в полной ростовой среде из расчета 1х106 клеток в 1 мл и высевают в ячейки 96- луночного планшета. Клетки выращивают в СО2 – инкубаторе при температуре 370С в атмосфере с 5% СО2. Литература : 1. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология) // Методы культивирования клеток, Л.; Наука.1987.с.194-205. 2. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.В. Биотехнология. Кн.3. Клеточная инженерия. Методы получения моноклональных антител. Стр.136-167. 3. Булашев А.К. Моноклональные антитела в диагностике бруцеллеза. Акмола.: Изд-во Акмолинского аграрного университета, -1995. –214с. Контрольные вопросы: 1. Значение «питающего слоя» при получении гибридом. 2. Источники «макрофагов» и их оптимальная концентрация. Занятие №6 Рисунок 3 – Схема постановки Иммуноферментного анализа
линов мыши, меченых перокси-дазой – антивидовой конъюгат («Sigma», США) и инкубируют 1 час при 370С. Повторяли процедуру отмывки для удаления несвязанных продуктов реакции и в лунки вносили по 0, 1 мл раствора субстрата фермента. Субстрат готовили непосред-ственно перед использованием путем растворения 0, 01 г ортофенилендиамина (ОФД) (Sigma, США) в 10 мл 1% раствора лимонной кислоты с рН 4, 5 и добавлением 0, 005 мл 30% перекиси водорода. Положи-тельная реакция характеризуется окрашиванием раствора субстра-та в желто-коричневый цвет. В качестве отрицательного контро-ля использовали супернатант миеломной линии клеток X 63.-Ag8.6.5.3. Реакцию останавлива- ли добавлением в лунки планшет раствора 2М серной кислоты. Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра (Dynateck, Германия) при длине волны 492 нм. Культуральная среда гибридом, оптическая плотность которой в 2 и более раза превышала значение отрицательного контроля, считалась положительной. Анализ позитивных клонов повторяется неоднократно для большей достоверности результатов. Реакция микроагглютинации. Реакцию микроагглютинации проводили в ячейках 96-луночного планшета для иммунологических реакции с коническим дном. В лунки планшета вносили по 0, 05 мл ЗФР (рН 7, 2-7, 4) и готовили двукратные разведения испытуемых антителосодержащих биологических жидкостей – культуральной среды гибридом (1: 2 и выше), очищенных моноклональных антител из асцитной жидкости (1: 100 и выше) в объеме 0, 05мл. Затем в каждую ячейку вносили по 0, 005 мл суспензии бактериальных клеток в концентрации 1х10 кл/мл. Планшет осторожно встряхивали и выдерживали 2 часа в термостате при 37оС, а затем 16-18 часов при 4оС. В качестве контроля использовали культуральную среду или асцитную жидкость миеломной линии клеток. Результаты реакции учитывали визуально и определяли в крестах по следующей схеме: (++++) – полное просветление жидкости и образование агглютината на дне лунки в виде перевернутого ”зонтика”, при встряхивании “зонтик” разбивается на хлопья; (+++) – неполное просветление жидкости и хорошо выраженный “зонтик”; (++) – заметное просветление жидкости, ”зонтик” выражен умеренно; (+) –едва заметное просветление жидкости, “зонтик” выражен слабо; (-) – просветления жидкости не наступило, на дне лунки осадок в виде “пуговки”, при легком встряхивании образуется равномерная взвесь. За титр антител принимали последнее разведение испытуемой антителосодержащей биологической жидкости, в котором произошла агглютинация не менее чем на 2 креста (++). Литература: 1. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология) // Методы культивирования клеток, Л.; Наука.1987.с.194-205. 2. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.В. Биотехнология. Кн.3. Клеточная инженерия. Методы получения моноклональных антител. Стр.136-167. 3. Булашев А.К. Моноклональные антитела в диагностике бруцеллеза. Акмола.: Изд-во Акмолинского аграрного университета, -1995. –214с. Контрольные вопросы: 1.На чем основаны методы тестирования гибридом. 2. Сущность иммуноферментного анализа.
Занятие №9 Тема: Клонирование гибридом
Цель занятия: необходимость этапа клонирования в гибридомной технологии, сущность метода лимитирующего разведения. Материальное обеспечение: 96-луночные планшеты с макрофагами, 24-луночные планшеты с гибридомами, камера Горяева, пробирки для разведения суспензии клеток, автоматические дозаторы
Для получения моноклональных антител необходимо, чтобы производящие их гибридные клетки были потомками одной (единичной) клетки. Однако в большинстве ячеек могут обнаруживаться смеси клонов гибридом-продуцентов или смеси клонов гибридом-продуцентов и клонов гибридом-непродуцентов. Кроме того, для недавно образованных гибридом характерна высокая нестабильность, связанная с утратой хромосом. Эти клетки, потерявшие способность продуцировать антитела, могут перерастать антителообразующие гибридные клетки. С целью изолирования клонов гибридом, стабильно секретирующих МКА, осуществляют клонирование. Наиболее распространенным способом клонирования является метод лимитирующего разведения в жидкой фазе. Согласно распределению Пуассона, для того чтобы получить разумную вероятность только одного клона в лунке, клетки необходимо засевать при плотности 10, 1 и 0, 5 клеток на лунку. При первом клонировании активной, т.е. продуцирующей антитела, может оказаться только небольшая часть клонов. Необходимо всегда производить повторное клонирование, при котором доля положительных клонов будет возрастать. Клонирование гибридом методом лимитирующих разведений. Ячейки 96-луночного планшета для культивирования клеток предварительно засевают перитонеальными макрофагами (1х10 кл в 0, 1 мл ростовой среды на лунку) и инкубируют 1-2 суток при 370С в атмосфере с 5%СО2. Подсчитывают концентрацию клеток в ячейках 24-луночного планшета с растущими гибридомами. Для клонирования выбираются ячейки с жизнеспособными клетками, находящимися в логарифмической фазе роста. Суспензию клеток разводят в культуральной среде до конечной концентрации 10, 1 и 0, 5 клеток в 1 мл и рассеивают на 96-луночные планшеты с питающими клетками по 0, 1 мл на ячейку. Инкубируют клетки при 370С в атмосфере с 5%СО2 .Колонии растущих клеток становятся видимыми под микроскопом через 5-7 суток. Антительную активность клеток-субклонов определяют с помощью ИФА и РМА на 10 – 14-е сутки после клонирования. В течение этого периода смену среды не проводят. Для определения активности гибридом выбирают ячейки, содержащие единичные колонии клеток. Позитивные клоны, т.е. клоны гибридом-продуцентов МКА, подвергают реклонированию по описанному методу. Литература: 1. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология) // Методы культивирования клеток, Л.; Наука.1987.с.194-205. 2. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.В. Биотехнология. Кн.3. Клеточная инженерия. Методы получения моноклональных антител. Стр.136-167. 3. Булашев А.К. Моноклональные антитела в диагностике бруцеллеза. Акмола.: Изд-во Акмолинского аграрного университета, -1995. –214с. Контрольные вопросы: 1. Необходимость этапа клонирования в гибридомной технологии. 2. Сущность метода лимитирующих разведении.
Занятие №10 Специфичности
Цель занятия: освоить методики очистки моноклональных антител, определения их константы связывания и классов иммуноглобулинов.
Моноклональные антитела можно определить как химический реагент известной структуры, который можно получить по желанию, тогда как соответствующая антисыворотка является вариабельной смесью реагентов и никогда не может быть в точности воспроизведена после гибели исходного животного. Источником получения неограниченного количества МКА служит культивирование клеток гибридом в брюшной полости сингенных мышей. Иммуноглобулиновую фракцию из асцитной жидкости получают осаждением белков насыщенным раствором сульфата аммония с последующим диализом. Выделение чистых антител лучше всего проводить на иммуносорбентах, представляющих собой ковалентно сшитый с каким-либо носителем антиген. Обычно носителем служит сефароза. Наиболее простым методом является хроматография на сефарозе с пришитым ковалентно белком А - продуктом бактериальных клеток (Staphylococcus aureus), обладающий высоким сродством к Fc фрагменту антител. После получения очищенных и концентрированных препаратов МКА в иммунологических реакциях определяют специфичность их действия. Проводят как качественные, так и количественные определения. Антитела гетерогенны по принадлежности к различным классам и подклассам, а также по физико-химическим и биологическим свойствам. Активность связывания антител с антигеном оценивается как аффинность, что характеризует уровень родства антител к испытуемому антигену. Высокоаффинные антитела образуют более прочные комплексы с антигеном, чем низкоаффинные. Определение константы связывания (Ксв), которая является как известно мерой аффиности, а также титров МКА в иммунологических реакциях позволяет сделать вывод о их пригодности в разработке методов обнаружения специфических антигенов или антител возбудителей инфекционных заболеваний в различных биологических жидкостях. Класс и подкласс МКА определяют с помощью метода иммунодиффузии по Оухтерлони. Для идентификации класса антител используют набор антисывороток, специфических к отдельным классам и подклассам антител, которые производятся многими фирмами. Специфичность МКА к детерминантам антигена-иммуногена определяют также методом иммуноблотинга, т.е. посредством перевода электрофореграммы специфических антигенов, использованных для иммунизации мышей, на нитроцеллюлозную мембрану с последующим иммунохимическим проявлением. Антигены разделяют методом электрофореза в агарозном геле, затем гель помещают на лист нитроцеллюлозы и пропускают через него соответствующий буферный раствор в направлении от геля к нитроцеллюлозной бумаге.При этом фрагменты антигена элюируются из геля и связываются с нитроцеллюлозной мембраной, на котором в результате получается реплика геля. Такой перенос называется блоттинг (от англ.blot –промокать). После иммунохимического проявления нитроцеллюлозной мембраны выявляется четко воспроизводимый набор полос, соответствующих специфическому антигену. ПРИЛОЖЕНИЕ Забуференный физиологический раствор (ЗФР) – готовят путем растворения 8, 775 г натрия хлористого и 3, 58 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного в 1000 см3 дистиллированной воды, рН доводят до 7, 2-7, 4 с помощью натрия фосфорно Популярное:
|
Последнее изменение этой страницы: 2016-03-25; Просмотров: 1025; Нарушение авторского права страницы
